蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)

蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)第一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)

DE（directedevolutionofprotein）始于上世紀(jì)70年代，最早的一個(gè)例子是進(jìn)化一個(gè)來源于大腸桿菌的EbgA蛋白，這個(gè)酶幾乎不具備β-半乳糖苷酶的活性。通過以乳糖為單一碳源的平板上篩選Lac-缺失的大腸菌株，野生型的EbgA就進(jìn)化成為了具有β-半乳糖苷酶活性的酶。第二頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)★定義（definition）★原理（theory）★隨機(jī)突變的策略（markedfeatures）★定向進(jìn)化的選擇的策略（methods）★應(yīng)用及展望（applicationandprospects）

第三頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)定義定向進(jìn)化技術(shù)是一種在生物體體外(試管中)模擬達(dá)爾文進(jìn)化，利用自然選擇的動(dòng)力進(jìn)化出在自然界并不存在的或是具有更優(yōu)性質(zhì)的蛋白。第四頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)

生物在漫長的時(shí)間里經(jīng)過自發(fā)突變（突變與重組），通過自然選擇，逐漸形成了多樣性的生物。自然選擇自發(fā)、不定向、自然選擇、慢分子定向進(jìn)化

基因在短時(shí)間內(nèi)通過人為引發(fā)突變，經(jīng)過人工篩選，形成滿足人們需要的新功能或者優(yōu)良性能生物物質(zhì)（酶蛋白）人為、定向、人工選擇、快第五頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)原理

DE的原理是對(duì)目的基因進(jìn)行突變、重組、表達(dá)和篩選,在試管內(nèi)模擬蛋白質(zhì)的自然進(jìn)化過程,獲取人們需要的、具有特定性質(zhì)和功能的蛋白質(zhì)。定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+選擇第六頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一

隨機(jī)突變的策略■易錯(cuò)PCR■

DNA改組和外顯子改組■雜合蛋白質(zhì)■體外隨機(jī)引發(fā)重組■交錯(cuò)延伸第七頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)●易錯(cuò)PCR

易錯(cuò)PCR是指通過改變PCR的反應(yīng)條件，如：調(diào)整反應(yīng)體系中4種dNTP的濃度、增加Mg2+

的濃度等，使堿基在一定程度上隨機(jī)錯(cuò)配而引入多點(diǎn)突變，構(gòu)建突變庫，刷出所需的突變體。易錯(cuò)PCR的關(guān)鍵是控制DNA的突變頻率。第八頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)●DNA改組

DNA改組又稱有性PCR，目的是創(chuàng)造將親本基因群中的突變盡可能組合的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致更大的變異，最終獲得最佳突變組合的蛋白質(zhì)。第九頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)●雜合蛋白質(zhì)

把不同蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)單元或整個(gè)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行組合或交換，以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的優(yōu)化蛋白質(zhì)雜合體。第十頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)●體外隨機(jī)引發(fā)重組

以單鏈DNA為模板，配合一套隨機(jī)序列引物，先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短DNA片段，由于堿基的錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會(huì)有少量的點(diǎn)突變，在隨后的PCR反應(yīng)中，它們互為引物進(jìn)行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長度。第十一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)●交錯(cuò)延伸

一種簡化的DNA重組方法，它不是由短片段組裝全長基因，而是在PCR反應(yīng)中，將含不同點(diǎn)突變的模板混合，隨之進(jìn)行多輪變性、短暫復(fù)性及延伸反應(yīng)，在每一輪中，那些部分延伸的片段可以隨機(jī)地雜交到含不同突變的模板上繼續(xù)延伸，由于模板轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)不同模板間的重組，如此重復(fù)直至獲得全長基因片段。第十二頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一定向進(jìn)化的選擇策略Venekei等人報(bào)道了有效快速篩選蛋白水解酶突變體的方法和篩選條件，主要是利用蛋白酶選擇平板初選，再配合活性染色和X-光片消滅分析加以驗(yàn)證，并檢測其活力快速篩選了44000個(gè)突變株。Roberts等人用嗜菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)篩選與嗜中性酯酶結(jié)合力更強(qiáng)的抑制劑。從含有4900個(gè)突變體的基因庫中，獲得與該酶的結(jié)合能力高于野生蛋白質(zhì)3600000倍的突變體，比已報(bào)道的任何一個(gè)相應(yīng)的抑制劑高50倍。第十三頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一定向進(jìn)化的展望不僅能使蛋白質(zhì)進(jìn)化出非天然特性，還能定向進(jìn)化某一代謝途徑；不僅能進(jìn)化出具有單一優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)，還可能是已分別優(yōu)化的蛋白質(zhì)的兩個(gè)或多個(gè)特性疊加，產(chǎn)生具有多項(xiàng)優(yōu)化功能的蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)展和豐富蛋白質(zhì)資源；完全在試管中進(jìn)行的蛋白質(zhì)的體外定向進(jìn)化使在自然界需要幾百萬年的進(jìn)化過程縮短至幾年。第十四頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化的應(yīng)用及展望●提高酶的催化活性●提高酶的穩(wěn)定性●改變酶的底物特異性●改變對(duì)映異構(gòu)體特異性第十五頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)◆提高酶的催化活性

Shim等采用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建的突變體，改變了位于酶活性中心“蛋白-s-結(jié)合”口袋中Met-317，并突變?yōu)锳la，從而有利于底物范圍的擴(kuò)大；

Potocki—Veronese等利用易錯(cuò)PCR和DNA重組技術(shù)對(duì)其進(jìn)行突變，得到催化蔗糖活性提高60％的突變體Asn387Asp，從而擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，在實(shí)際生產(chǎn)中具有重要意義。第十六頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)第十七頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)◆提高酶的穩(wěn)定性

Xiao等運(yùn)用序列比對(duì)的結(jié)果為指導(dǎo)，進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到突變體的Tm值提高了6℃，同時(shí)在不影響原有催化活性的基礎(chǔ)上，在45℃時(shí)的半衰期比原酶提高了23倍之多。

Miyazaki等為了適應(yīng)生產(chǎn)化需要，綜合了隨機(jī)突變、定點(diǎn)飽和突變和DNA重組的方法，將11家族木聚糖酶進(jìn)行改造以提高其熱穩(wěn)定性。最終得到的突變體的半熱變性溫度從58℃提高到68℃，最適溫度也從55℃升到了65℃，同時(shí)在60℃的熱穩(wěn)定性也明顯增強(qiáng)。第十八頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)◆改變酶的底物特異性

Manu等通過對(duì)纖維二糖磷酸化酶(CP)進(jìn)行易錯(cuò)PCR篩選，得到的突變株作用底物從傳統(tǒng)的纖維二糖轉(zhuǎn)變成了乳糖，隨即提高了乳糖磷酸化酶的活性。最終得到的突變體菌株的乳糖磷酸化酶的活性比原酶高出了10倍。

第十九頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)

◆改變對(duì)映異構(gòu)體特異性

（1）Schmidt等選用易錯(cuò)PCR技術(shù)將來源于Pseudomonasfluoresce~酯酶的對(duì)應(yīng)選擇性野生型的E值從63提高至96，同時(shí)活性也相應(yīng)的增加了，能夠達(dá)到2min轉(zhuǎn)化50％的底物，相當(dāng)于1．25U／mg的蛋白量。第二十頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)（2）1998年，Arnold等運(yùn)用易錯(cuò)PCR和飽和誘變的方法，成功地使一株傾向于D-型底物的乙內(nèi)酰脲酶發(fā)生轉(zhuǎn)變，使之變?yōu)閮A向于L-型底物，經(jīng)過分析這種轉(zhuǎn)變只生發(fā)了一個(gè)氨基酸的替換。與野生型的催化蛋白相比，增加了L-甲硫氨酸的產(chǎn)量