環(huán)境生物化學基礎 第10章 核酸代謝

第10章核酸代謝第10章核酸代謝第1節(jié)核酸的酶促降解

一.核酸酶促降解

二.核酸酶

第2節(jié)核苷酸的分解代謝一.嘌呤的分解二.嘧啶的分解第3節(jié)核苷酸的合成代謝一、嘌呤核苷酸的生物合成二、嘧啶核苷酸的生物合成三、脫氧核糖核苷酸的生物合成四、核苷三磷酸及脫氧核苷三磷酸的合成五、核苷酸合成的抑制劑六、核苷酸輔酶的合成第四節(jié)DNA的生物合成和損傷修復一、DNA的生物合成二、DNA的損傷與修復

第五節(jié)RNA的生物合成一、概述二、RNA聚合酶三、RNA的轉錄過程四、真核細胞轉錄的特點五、轉錄過程的抑制劑六、轉錄后加工七、RNA的編輯、再編輯八、RNA的復制第一節(jié)核酸酶促降解一、核酸酶促降解動物和厭氧微生物可以分泌消化酶分解食物、體外的核蛋白和核酸類物質，以獲得各種核苷酸。植物不消化體外的有機質，但是生物體存在分解核酸的酶系。外源核酸不能直接被人體細胞吸收利用，人體所需的核酸都是自身合成的。二、核酸酶（一）外切核酸酶外切核酸酶作用于核酸鏈的一端，逐個水解下核苷酸，它們是非特異性的水解磷酸二酯鍵的酶。（二）內切核酸酶催化多核苷酸鏈內部磷酸二酯鍵水解的酶稱為內切酶。不同內切酶可以在多核苷酸鏈內不同位置水解磷酸二酯鍵，水解時既可以在3'，5'-磷酸二酯鍵的3'酯鍵處，也可以在5'酯鍵處切斷磷酸二酯鍵。（三）核糖核酸酶

RNase是一類水解RNA中磷酸二酯鍵的內切酶，特異性較強，主要有RNaseⅠ、RNaseⅡ和RnaseU2等。這幾種RNase具有特定的作用位點，如RnaseU2特異性作用于嘌呤核苷酸C（3'）位磷酸與其相鄰核苷酸C（3'）位間的磷酸酯鍵。（四）脫氧核糖核酸酶

DNase一類內切核酸酶，作用于DNA的磷酸二酯鍵，催化DNA水解，包括DNaseⅠ、DNaseⅡ和限制性核酸內切酶。

第二節(jié)核苷酸的分解代謝一、嘌呤的分解嘌呤堿的分解首先在脫氨酶的作用下脫去氨基，腺嘌呤和鳥嘌呤水解脫氨分別生成次黃嘌呤和黃嘌呤。腺嘌呤的脫氨在核苷或核苷酸水平上發(fā)生，然后再將脫氨基生成的次黃嘌呤核苷或次黃嘌呤核苷酸水解生成次黃嘌呤。二、嘧啶的分解不同種類生物對嘧啶堿的分解過程也不完全相同。與嘌呤堿的分解類似，嘧啶分解時，有氨基的首先脫去氨基，在人和某些動物體內其脫氨的過程也可能是在核苷或核苷酸的水平上進行。胞嘧啶脫氨基即轉化為尿嘧啶；尿嘧啶再經還原打破環(huán)內雙鍵，水解開環(huán)成鏈狀化合物，繼續(xù)水解成CO2、NH3、β-丙氨酸。第三節(jié)核苷酸的合成代謝一、嘌呤核苷酸的生物合成生物體內的核苷酸合成代謝有兩條基本途徑：由游離堿基和核苷直接合成；或以氨基酸和某些小分子物質為原料，經一系列酶促反應從頭合成核苷酸。二者在不同組織的重要性各不相同，如肝組織主要進行從頭合成，而腦、骨髓等只能進行補救合成。（一）嘌呤核苷酸的從頭合成（主要合成途徑）除某些細菌外，幾乎所有的生物體都能合成嘌呤堿，此途徑主要是以CO2、甲酸鹽、甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺為原料合成嘌呤堿。

1次黃嘌呤核苷酸的合成嘌呤核苷酸合成的起始物質是5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP）。IMP的合成過程如下：

由次黃嘌呤合成腺嘌呤和鳥嘌呤的過程如下：（二）補救途徑在生命體降解形成的一部分嘌呤可以進一步降解生成尿酸或其他排泄物，但大部分嘌呤可以直接轉變?yōu)猷堰屎塑账嶂械泥堰识换厥?，這被稱作嘌呤核苷酸合成的補救途徑。二、嘧啶核苷酸的生物合成

嘧啶核苷酸的從頭合成途徑比嘌呤從頭合成途徑簡單，并且消耗ATP少，核素實驗表明，嘧啶環(huán)中的原子來自3個前體：即HCO3、谷氨酰胺和天冬氨酸。（一）尿嘧啶核苷酸的從頭合成（二）胞嘧啶核苷酸的合成尿嘧啶核苷酸（UMP）轉變?yōu)榘奏ず塑账崾窃谀蜞奏ず塑杖姿岬乃缴线M行的。

3嘧啶核苷酸合成的補救途徑生物體對外源的或核苷酸代謝產生的嘧啶堿和核苷可以重新利用，這被稱為嘌呤核苷酸的補救途徑，嘧啶核苷酸激酶在補救途徑中起著重要的作用。三、脫氧核糖核苷酸的生物合成（一）2‘-脫氧核糖核苷酸是DNA分子的構件分子。生物體中的脫氧核苷酸是由核糖核苷酸還原生成的。在大多數(shù)生物中，脫氧還原反應發(fā)生在核苷二磷酸水平。（二）DNA合成需要的TMP則是由dUMP甲基化形成的。四、核苷三磷酸及脫氧核苷三磷酸的合成核苷酸和核苷二磷酸不直接參加核酸的生物合成，而是轉化成相應的核苷三磷酸后再加入RNA或DNA，核苷酸轉化為核苷二磷酸需要激酶催化，這些激酶對堿基專一，對其底物所含核糖或脫氧核糖無特殊要求，反應通式：核苷二磷酸轉化為核苷三磷酸是由另一種激酶催化的，這種酶對堿基和戊糖無特殊要求，磷酸供體為ATP。

五、核苷酸合成的抑制劑（一）氨基酸類似物（二）葉酸類似物（三）堿基和核苷類似物六、核苷酸輔酶的合成

1.NAD+和NADP+生物合成生物體內色氨酸、煙酸或煙酰胺都可以作為NAD+和NADP+合成的起始物。色氨酸經一系列反應轉變成吡啶-2,3二羧酸，后者結合磷酸核糖焦磷酸（PRPP）轉移來的PPi基，同時釋放CO2生成煙酸單核苷酸，再經系列酶促反應生成NAD+和NADP+；某些生物可將色氨酸轉變?yōu)闊熕?，煙酸與PRPP作用生成煙酸單核苷酸，后者再與ATP反應，接受一分子AMP生成煙酸腺嘌呤二核苷酸，后者的羧基接受谷氨酰胺的酰胺基即生成NAD+，NAD+經磷酸化可得到NADP+；煙酰胺合成NAD+和NADP+的途徑與煙酸合成途徑基本相同。2.FMN和FAD的生物合成核黃素是合成FMN、FAD的起始物，生物體合成FMN、FAD的途徑基本相同。人體和高等動物不能合成核黃素，植物和許多微生物能合成核黃素，但是迄今研究的所有生物體都能利用核黃素，其反應為核黃素經ATP磷酸化即得FMN，F(xiàn)MN從第二個ATP分子取得AMP單位生成FAD。3.CoA的生物合成

CoA是酰基轉移酶的輔酶，CoA是從泛酸開始合成的。微生物可以從天冬氨酸起始合成CoA，高等動物不能合成泛酸，必須從食物中攝取泛酸才能合成CoA。微生物將天冬氨酸脫羧產生β-丙氨酸，β-丙氨酸與泛解酸作用合成泛酸，泛酸再經一系列酶促反應生成CoA。第四節(jié)DNA的生物合成和損傷修復一、DNA的生物合成（一）DNA復制概述

1半保留復制全保留復制和半保留復制開始都只是一種假說，直至1958年哈佛大學生物系教授MatthewMeselson和他的學生FranklinStahl的實驗直接證明了DNA的半保留復制方式。Meselson-stahl實驗2DNA復制的起點和方式復制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復制起始點(originofreplication)常用ori或o表示。在原核細胞中，每個DNA分子只有一個復制起始點，因而只有一個復制子，而在真核生物中，DNA的復制是從許多起始點同時開始的，所以每個DNA分子上有許多個復制子。每個復制子都含有一個復制起點。（二）DNA聚合反應有關的酶及相關蛋白因子1．DNA聚合酶1956年，由Kornberg等首先在大腸桿菌中分離出DNA聚合的酶，被命名為DNA聚合酶Ⅰ。70年代初期先后從大腸桿菌又分離出了兩種DNA聚合酶，分別命名為DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。這三種酶催化同一類聚合反應，DNA聚合酶Ⅱ沒有外切酶5’→3’的活力，而且活力低。DNA聚合酶Ⅲ的活力較強，為DNA聚合酶Ⅰ的15倍，DNA聚合酶Ⅱ的300倍。真核生物的DNA聚合酶有α、β、γ、δ和ε五種。DNApolδ催化前導鏈的合成；DNApolα在復制中主要起到校閱、修復和填補缺口的作用；DNApolβ也是一種修復酶，但它只在沒有其它酶作用時才發(fā)揮作用；DNApolγ催化線粒體DNA的合成。2．DNA連接酶

DNA連接酶起到填補空隙及催化滯后鏈合成的作用，DNA連接酶是1967年發(fā)現(xiàn)的，最初是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的。它是一種封閉DNA鏈上缺口的酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5‘-PO4與另一DNA鏈的3’-OH生成磷酸二酯鍵。這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結合的，而且必須是兩條緊鄰的DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵3．DNA解螺旋酶

DNA雙螺旋分子具有緊密纏繞的結構，而DNA發(fā)生聚合反應時，至少雙螺旋應部分解鏈并分開。而使DNA雙螺旋解旋并使兩條鏈保持分開的狀態(tài)是個極復雜的過程，研究證明某些酶和蛋白質，能使DNA雙鏈變得易于解開，每解開一對堿基，需消耗2分子ATP。大腸桿菌中的DNA解螺旋酶由dnaB基因編碼。4．DNA拓撲異構酶還有一種蛋白質稱為DNA旋轉酶（grase）或拓撲異構酶Ⅱ（typeⅡtopoisomerase），該酶兼有內切酶和連接酶的活力，能迅速使DNA鏈斷開又連上，當與ATP水解產生ADP與Pi的反應偶聯(lián)時，旋轉酶可使松弛態(tài)的DNA轉變?yōu)槌菪隣顟B(tài)，在沒有ATP時，又可使超螺旋DNA變成松弛態(tài)。（三）原核細胞DNA的復制過程原核生物DNA復制的全部過程可大致分為三個階段。第一個階段為DNA復制的起始階段，這個階段包括起始點，DNA模板解旋；第二個階段為引物的生成、DNA鏈的延長，前導鏈和隨后鏈的形成；第三個階段為DNA復制的終止階段，包括切除RNA引物后填補空缺及崗崎片段的延長和連接。（四）真核細胞DNA復制的特點（1）真核生物所含的DNA聚合酶種類更多些，真核生物至少含有5種不同的DNA聚合酶：DNA聚合酶α，DNA聚合酶β，DNA聚合酶γ，DNA聚合酶δ、DNA聚合酶δ。DNA聚合酶α、DNA聚合酶δ和DNA聚合酶δ是在細胞核內發(fā)現(xiàn)的，負責DNA的復制和某些DNA修復反應。（2）真核生物復制叉處需要的輔助蛋白不同。真核生物中有類似SSB的復制蛋白A（replicationfactorproteinA,RPF），有時也稱復制因子A。RPＡ由3個亞基組成，它與單鏈DNA結合緊密，增加滯后鏈DNA合成的效率。復制因子C（RPC）是多亞基蛋白，與DNApolδ結合，幫助它移動。

（3）真核生物的染色體存在許多復制起點，復制從每個起點雙向進行，相鄰復制叉彼此靠近，會合成更大的“泡”。如圖，王希成，192,盡管真核生物中的復制叉移動速度比原核生物慢，但由于存在大量的獨立的復制起點，所以就每個復制單位而言，復制所需時間在同一數(shù)量級。（五）反轉錄反轉錄（reversetranscription）是以RNA為模板，以dNTP為底物，tRNA（主要是色氨酸t(yī)RNA）為引物，合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條單鏈叫做互補DNA（complementaryDNA,cDNA）,隨后又在反轉錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。與傳統(tǒng)意義上的遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反，稱為反轉錄。（六）DNA的人工合成一．首先將欲合成寡核苷酸鏈3’末端核苷（N1）以其3’－OH通過長的烷基臂與固相載體，一般為不溶性的高分子化合物，常用有硅膠S、交聯(lián)的聚苯乙烯、特殊孔徑的多孔玻璃等）藕聯(lián)，N1的5’－OH以二甲氧基三苯甲基（DMTr）保護。然后從N1開始逐步地延長寡核苷酸鏈。

二．寡合苷酸鏈的合成第一步，去保護（deprotection），以苯磺酸或三氯醋酸處理保護基DMTr；第二步，歐聯(lián)反應（coupling），加入經四唑激活的核苷N2，與N1的5’OH藕聯(lián)反應；第三步，加帽反應（capping）,加入醋酐及二甲基氨基吡啶，使未進一步藕聯(lián)的寡合苷酸鏈乙?；岳诩兓康腄NA片段。第四步，氧化反應（oxidation）,加入碘，使三價的亞磷酸轉變?yōu)榉€(wěn)定的五價磷酸。（七）PCR技術及其在環(huán)境保護中的應用聚合酶鏈式反應（Polymerasechainreaction,PCR）是一種非常簡單有效的體外DNA聚合反應，能夠將樣品中的任一段目的片段在數(shù)小時內擴增109倍。該技術快速簡便，重復性好，特異性高，擴增效率強，除在疾病的早期診斷，法醫(yī)學鑒定，動植物學溯源分型廣泛應用外，也被引入環(huán)境保護的相關研究中。研究者利用PCR技術，擴增好氧污泥中的目的DNA片段，鑒定優(yōu)勢菌，從而確定有機負荷對好氧污泥微生物生物群落的影響。二．DNA的損傷與修復（一）DNA突變突變分為兩類：

1堿基對的置換（substitution），DNA錯配堿基在復制后被固定下來，由原來的一個堿基對被另一對堿基取代；

2移碼突變（frameshiftmutation），由于一個或多個非三整倍數(shù)的核苷酸對插入（insertion）或缺失（deletion），使編碼區(qū)該位點后的三聯(lián)體密碼子閱讀框架改變，通常導致產物會完全失活。(二)DNA損傷與修復

1．DNA損傷的類型

DNA的損傷分自發(fā)性損傷、物理因素引起的DNA損傷和化學因素引起的DNA損傷。來自細胞內部的損傷，指在復制過程中可能產生錯配，DNA的重組，病毒基因的整合，更可能會局部破壞DNA的雙螺旋結構的現(xiàn)象。這些損傷破壞的是DNA堿基、糖或是磷酸二酯鍵。2．DNA損傷修復的方式（1）直接修復（2）切除修復（3）錯配修復（4）重組修復第五節(jié)RNA的生物合成一、概述RNA的合成途徑包括三種：（一）DNA→RNA，以DNA為模板轉錄合成RNA，這是本章介紹的主要內容；（二）RNA→RNA，以RNA為模板合成RNA；（三）RNA→DNA→RNA。二、RNA聚合酶RNA聚合酶Ⅱ所在功能對抑制物的敏感性RNA聚合酶Ⅲ核仁合成ｔＲＮＡ前體對α—鵝膏覃堿不敏感RNA聚合酶Ⅲ核質合成ｍＲＮＡ前體及大多數(shù)ｓｎＲＮＡ對低濃度α—鵝膏覃堿敏感RNA聚合酶Ⅲ核質合成５ｓｒＲＮＡ前體，ｔＲＮＡ前體和其他的核和胞質?。遥危燎绑w對高濃度α—鵝膏覃堿敏感

二、RNA的轉錄過程原核細胞中轉錄酶存在于細胞液中，真核生物細胞中的轉錄在細胞核內進行的，合成mRNA、rRNA和tRNA前體。（一）模板的識別主要是依靠σ因子，σ因子能夠幫助RNA聚合酶穩(wěn)定地結合在DNA啟動子上。（二）轉錄起始：原核生物轉錄以E.coli為例，當RNA聚合酶全酶結合到模板上的啟動子后，就開始了RNA的合成，啟動子調控轉錄的進行。啟動子啟動轉錄需要識別兩段高度保守的DNA序列。即開始轉錄的第一個核苷酸的5’端之前的—35區(qū)，另一個為—10區(qū)。

（三）轉錄延伸核心酶沿模板鏈的3’→5’方向滑行，雙螺旋DNA解鏈，同時RNA鏈按5’→3’方向不斷延伸。轉錄形成的RNA暫時與DNA模板鏈形成DNA-RNA雜交體，當RNA鏈的長度超過12個堿基時，RNA的3’端仍與DNA形成雜交體，但是RNA的5’端很容易脫離DNA模板鏈，于是被轉錄過的DNA區(qū)段又重新形成雙螺旋。（四）轉錄終止無論是原核生物還是真核生物基因的編碼序列3’端都有稱為終止子（terminator）的轉錄終止信號。在E.coli中存在兩類終止子，結構上有自身特點。

1．不依賴ρ因子的終止子：這類終止子的轉錄產物有兩個特征：一是存在富含G-C的回文序列，可形成發(fā)夾結構，二是發(fā)夾結構之后有一串連續(xù)的U。當延伸復合物遇到發(fā)夾結構處時，即停止。

2．依賴ρ因子的終止子：這類終止子的轉錄產物不能形成發(fā)夾結構，ρ因子是一種原核生物的轉錄終止因子，能夠與RNA聚合酶復合物相互作用終止轉錄。四、真核細胞轉錄的特點真核生物轉錄的起始時，真核生物RNApol不與DNA分子直接結合，而需要眾多因子參與。例如轉錄起始前需要順式作用元件（cis-actingelement）,位于基因上游的一段富含TA的序列；另外還需要反式作用因子（trans-actingfactors），即能直接、間接和結合轉錄上游區(qū)段DNA的蛋白質。此外由于真核生物的DNA結構特點，RNApol前移會遇上核小體的移位和解聚現(xiàn)象。五、轉錄過程的抑制劑

RNA合成的抑制劑放線菌素D和利福霉素等一些抗生素是RNA合成的抑制劑。利福霉素（Rifamycin）是另一個非常有用的抗生素，也是從鏈霉菌分離出來的。鵝膏蕈堿（α-Amanitin）：是一種來自毒蘑菇鬼筆鵝蕈(Amanitaphalloides)的真菌毒素，二環(huán)八肽，能抑制真核RNA聚合酶Ⅱ與RNA聚合酶Ⅲ轉錄。六、轉錄后加工

RNA聚合酶轉錄合成的RNA稱為初始轉錄物（primarytranscript），大多要經過加工才能得到有生物學功能的成熟RNA分子，該加工過程稱為轉錄后加工。（一）mRNA的加工在原核生物中，大多數(shù)初始mRNA直接進行翻譯了。真核生物與原核生物不同，真核生物的mRNA在細胞和中合成，而翻譯過程在細胞質中進行。且真核生物蛋白質基因多為斷裂基因，其外顯子和內含子均被轉錄，所以mRNA需在細胞核內加工為成熟的mRNA，再被運輸?shù)郊毎|內作為模板進行翻譯。1.加帽

2．mRNA前體的剪接：真核生物基因的編碼序列中分散著一些非基因或稱為不能表達的區(qū)域，轉錄后仍然存在于初始轉錄產物中，這樣的轉錄產物稱為前信使RNA（pre-mRNA）或核內不均一RNA（heterogeneousRNA,hnRNA）。我們將前信使RNA中的非表達的插入序列稱為內含子（intron）,表達的序列稱為外顯子（exon）。將內含子切除，外顯子連接在一起的過程稱為mRNA前體的剪接（RNASplicing）。3．加尾巴：

mRNA3’末端的多聚腺苷酸（polyA）也是轉錄后加上去的。先由核酸外切酶切去3’末端的一些核苷酸，加尾過程是在核內進行的，在核內多聚腺苷酸聚合酶催化下，以ATP為引物，在hnRNA的3’末端加上一段多聚腺苷酸約（100～200個腺苷酸），從而形成poly尾。polyA尾的功能是：①保護mRNA不被水解；②引導mRNA有細胞核進入細胞質。

（二）rRNA的加工

rRNA的加工主要有兩種方式（1）1982年，CechT發(fā)現(xiàn)四膜蟲（tetrahymena）初始轉錄rRNA不需要一般的核酸酶等蛋白酶類，可自我催化完成剪接。rRNA前體的剪接不需要任何蛋白質參與即可發(fā)生，這就說明了RNA本身即具有酶的催化作用。因而Cech將這種具有催化功能的酶命名為核酶(ribozyme)。這是人們對RNA分子功能認識的一個重大突破。

（2）rRNA前體加工的另一種形式是化學修飾，主要是甲基化反應。甲基化主要發(fā)生在核糖的2’-羥基上。此