第四章目的基因的獲得酵母雙雜交

酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能通過報告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測得到。一、酵母雙雜交系統(tǒng)簡介它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。

該技術(shù)既可用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用。當(dāng)前第1頁\共有57頁\編于星期六\9點經(jīng)典文獻(xiàn)出處FieldsS,SongO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.

Nature,1989,340(6230):245-246二、酵母雙雜交系統(tǒng)的建立當(dāng)前第2頁\共有57頁\編于星期六\9點該系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識。真核生物基因轉(zhuǎn)錄需要反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，真核生長轉(zhuǎn)錄因子含有兩個不同的結(jié)構(gòu)域：轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNAbindingdomain)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activationdomain)1989年美國紐約州立大學(xué)的Fields和Song首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem)。當(dāng)前第3頁\共有57頁\編于星期六\9點這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響，單獨存在時沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過共價或非共價鍵連接建立起來的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子的功能。當(dāng)前第4頁\共有57頁\編于星期六\9點目前酵母雙雜交實驗采用的系統(tǒng)有LexA系統(tǒng)和Gal4系統(tǒng)兩種。在LexA系統(tǒng)中，DNA結(jié)合域由一個完整的原核蛋白LexA構(gòu)成，轉(zhuǎn)錄激活域則由一個88個氨基酸的酸性的大腸桿菌多肽B42構(gòu)成，它在酵母中可以活化基因的轉(zhuǎn)錄;在Gal4系統(tǒng)中，BD和AD分別由Gal4蛋白上不同的兩個結(jié)構(gòu)域(1-147aa與768-881aa)構(gòu)成。當(dāng)前第5頁\共有57頁\編于星期六\9點

兩個結(jié)構(gòu)域中的BD由位于N-末端的1～147位多肽構(gòu)成，能識別位于Gal4基因的上游激活序列(upstreamactivationsequence，UAS)。此外，在其N-端還具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768～881位多肽構(gòu)成。Gal4的兩個結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們在空間上充分接近，則能恢復(fù)Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。Gal4為酵母半乳糖苷酶基因gal1的轉(zhuǎn)錄激活因子，天然的Gal4分子是由一條由881個氨基酸殘基組成的多肽鏈。當(dāng)前第6頁\共有57頁\編于星期六\9點

Fields和Song將兩個融合蛋白分別構(gòu)建在穿梭質(zhì)粒上，一個是將Gal4的DNA-BD與酵母蛋白SNF1融合；另一個是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。其中，SNF1是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一個結(jié)合蛋白，這兩種蛋白是已知可以相互作用的。當(dāng)前第7頁\共有57頁\編于星期六\9點當(dāng)兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Gal4結(jié)合位點的報告基因LacZ的酵母菌株后，通過SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD與Gal4的AD靠近,形成一個大的復(fù)合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的DNA-BD可識別位于Gal4效應(yīng)基因的UAS，并可與之結(jié)合；Gal4的AD則可與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中其他成分結(jié)合，激活UAS下游報告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)前第8頁\共有57頁\編于星期六\9點三、酵母雙雜交系統(tǒng)的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneXDNA-BD當(dāng)前第9頁\共有57頁\編于星期六\9點許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個在結(jié)構(gòu)上可以分開的、功能上也相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成。1.結(jié)構(gòu)域（Domain）合作當(dāng)前第10頁\共有57頁\編于星期六\9點例如：啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNAbindingdomainActivedomainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄激活GAL4效應(yīng)基因結(jié)合結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄實驗發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)錄表達(dá)只要DNAbindingdomain（DNA-BD）與Activedomain（AD）靠近就能激活轉(zhuǎn)錄。當(dāng)前第11頁\共有57頁\編于星期六\9點2.拆開DomainDNAbindingdomainActivedomain上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄激活GAL4效應(yīng)基因結(jié)合用重組DNA技術(shù)把GAL4的兩個Domain分開，就喪失了激活效應(yīng)基因的能力。不能轉(zhuǎn)錄當(dāng)前第12頁\共有57頁\編于星期六\9點3.重組Domain用重組DNA技術(shù)把這兩個Domain分別與兩個不同的多肽連接。Activedomain蛋白A蛋白BDNAbindingdomain在體內(nèi)，蛋白A與蛋白B是否能結(jié)合。4.觀察報告基因表達(dá)當(dāng)前第13頁\共有57頁\編于星期六\9點GAL4的BDdomain與ADDomain也不能靠近，所以仍然不能啟動效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。（1）如果蛋白A與蛋白B不能相互結(jié)合（2）如果蛋白A與蛋白B能相互結(jié)合上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄激活GAL4效應(yīng)基因蛋白ADNAbindingdomain轉(zhuǎn)錄激活domain蛋白B激活轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄表達(dá)當(dāng)前第14頁\共有57頁\編于星期六\9點X基因和Y基因產(chǎn)物的相互結(jié)合，導(dǎo)致reportergene表達(dá)。Reportergene表達(dá)就說明X基因產(chǎn)物與Y基因產(chǎn)物能結(jié)合。雙雜交原理當(dāng)前第15頁\共有57頁\編于星期六\9點當(dāng)前第16頁\共有57頁\編于星期六\9點酵母細(xì)胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點:易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報告基因酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白相互結(jié)合報道株經(jīng)改造的、含報告基因的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞當(dāng)前第17頁\共有57頁\編于星期六\9點基因組中GAL4基因是缺失型的基因組中引入額外的報告基因LEU、TRP、HIS改造后的酵母細(xì)胞的特點：通過功能互補和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落當(dāng)前第18頁\共有57頁\編于星期六\9點

表達(dá)“誘餌”和“獵物”蛋白；檢驗這兩種蛋白表達(dá)后能否激活酵母中的報告基因。做法：首先構(gòu)建能表達(dá)“誘餌”和“獵物”蛋白的表達(dá)載體。該載體中可加入進(jìn)行營養(yǎng)型篩選的基因。四、酵母雙雜交系統(tǒng)的基本策略當(dāng)前第19頁\共有57頁\編于星期六\9點五、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點高敏感性。原因：①采用高拷貝和強啟動子的表達(dá)載體，使融合蛋白過量表達(dá)；②激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，之后又與啟動子結(jié)合，此三元復(fù)合體使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定；③通過mRNA使信號放大；④檢測的結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的累積效應(yīng)，可檢測存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時的相互作用。當(dāng)前第20頁\共有57頁\編于星期六\9點五、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點2.真實性。檢測在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實情況。3.簡潔性。融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。4.廣泛性。采用不同組織器官細(xì)胞類型和分化時期的材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析不同亞細(xì)胞部位和功能的蛋白質(zhì)，適用于部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白。當(dāng)前第21頁\共有57頁\編于星期六\9點

分析已知蛋白之間的相互作用對蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測蛋白質(zhì)進(jìn)行點突變或缺失突變再進(jìn)行雙雜交。用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫，再根據(jù)篩的已知基因推測新基因功能。繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜在藥物設(shè)計中的應(yīng)用六、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀當(dāng)前第22頁\共有57頁\編于星期六\9點1.利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的新功能將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-文庫載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。當(dāng)前第23頁\共有57頁\編于星期六\9點

利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，可研究抗原和抗體之間的相互作用，但它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交進(jìn)行檢測。2.利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用當(dāng)前第24頁\共有57頁\編于星期六\9點3.利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響

對于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白相互作用可采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的。當(dāng)前第25頁\共有57頁\編于星期六\9點4.利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（GenomeProteinLinkageMap）基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列。利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達(dá)文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對于認(rèn)識一些重要的生命活動：如信號傳導(dǎo)、代謝途徑等有重要意義。當(dāng)前第26頁\共有57頁\編于星期六\9點七、酵母雙雜交系統(tǒng)中常見問題的解決和改進(jìn)措施（一）假陽性較多（二）轉(zhuǎn)化效率偏低（三）陰性干擾當(dāng)前第27頁\共有57頁\編于星期六\9點假陽性定義：在待研究的兩個蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下，報告基因仍被激活。（一）假陽性較多

①BD融合誘餌蛋白的單獨激活作用。這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。②如AD融合靶蛋白有DNA的特異性結(jié)合，則可單獨激活報告基因的表達(dá)。③AD融合蛋白直接與轉(zhuǎn)錄因子作用激活報告基因；④AD融合靶蛋白與BD相互作用或者AD與BD融合蛋白之間的相互作用，尤其是后者帶來許多假陽性。原因：當(dāng)前第28頁\共有57頁\編于星期六\9點排除假陽性的措施

①作嚴(yán)格的對照試驗。應(yīng)對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定。②采用多個報告基因，且每個報告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同。目前試劑公司已采用。③報告基因整合到染色體上，可使基因表達(dá)水平穩(wěn)定。④優(yōu)化3-AT(3-aminotriazole，3-氨基三唑

)濃度。適當(dāng)增加濃度可減少假陽性。當(dāng)前第29頁\共有57頁\編于星期六\9點進(jìn)一步分析：①這種相互作用是否會在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生。②有些蛋白依賴于泛素的蛋白酶降解途徑成員，它們具有普遍的蛋白間的相互作用。③一些實際沒有相互作用的蛋白但有相同的模體蛋白也可發(fā)生相互作用。排除假陽性的措施當(dāng)前第30頁\共有57頁\編于星期六\9點原因：由于酵母轉(zhuǎn)化效率較細(xì)菌低4個數(shù)量級，因此轉(zhuǎn)化成為雙雜交技術(shù)的重要瓶頸。解決辦法：引進(jìn)酵母接合型

a接合型和接合型（兩者之間可形成二倍體，但自身不能）（二）轉(zhuǎn)化效率偏低當(dāng)前第31頁\共有57頁\編于星期六\9點接合型酵母細(xì)胞cDNA文庫誘鉺蛋白基因多克隆位點DNA-BD載體AD載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化a接合型酵母細(xì)胞篩選平板生長菌苔篩選平板生長菌苔同一個三重篩選平板克?。ㄕT餌與靶蛋白相互作用）鑒定β-半乳糖苷酶部分已商品化當(dāng)前第32頁\共有57頁\編于星期六\9點（三）陰性干擾融合蛋白的表達(dá)對細(xì)胞有毒性，該怎么辦？應(yīng)選擇敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。蛋白在酵母中不能穩(wěn)定地表達(dá)，或者不能正確地折疊，或雜交蛋白不能轉(zhuǎn)入胞核。兩個蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測不出來。原因：當(dāng)前第33頁\共有57頁\編于星期六\9點

酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法，有多方面的應(yīng)用，但仍存在一些局限性。八、酵母雙雜交系統(tǒng)使用注意事項當(dāng)前第34頁\共有57頁\編于星期六\9點酵母雙雜交系統(tǒng)局限性某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì)。---------雙雜交前刪除該部分，但應(yīng)避免刪除相互作用的結(jié)構(gòu)域某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達(dá)或不能準(zhǔn)確定位到胞核內(nèi)。在細(xì)胞表面發(fā)生的相互作用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)。

雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進(jìn)行。

當(dāng)前第35頁\共有57頁\編于星期六\9點酵母雙雜交系統(tǒng)局限性有時DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位點，或破壞了融合蛋白的正確折疊。4.哺乳動物蛋白之間相互作用有時要求正確的折疊和翻譯后修飾，而酵母細(xì)胞不能提供這樣的環(huán)境。這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究陽性克隆必須進(jìn)行體外翻譯和表達(dá)，用抗原表位特異性的抗體進(jìn)行共定位研究。雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結(jié)果一定要通過其它的實驗手段來驗證。當(dāng)前第36頁\共有57頁\編于星期六\9點

在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展：酵母單雜交--用于核酸和文庫蛋白之間的研究酵母三雜交--三種不同蛋白之間的互作研究酵母的反向雜交--兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點。反向雙雜交系統(tǒng)和三雜交技術(shù)當(dāng)前第37頁\共有57頁\編于星期六\9點(一)酵母單雜交系統(tǒng)(one-hybridsystem)1993年，由Wang和Reed等相繼創(chuàng)立發(fā)展出一種研究蛋白質(zhì)和DNA相互作用的實驗體系。WangMM,ReedRR.MolecularcloningoftheolfactoryneuronaltranscriptionfactorOlf-1bygeneticselectioninyeast.Nature，1993，364(6433):121-126.文獻(xiàn)出處當(dāng)前第38頁\共有57頁\編于星期六\9點酵母單雜交系統(tǒng)原理在酵母單雜交系統(tǒng)中，省略了在酵母雙雜交系統(tǒng)中采用的BD-X蛋白質(zhì)雜交體，而用特異的DNA序列取代DNAGal4結(jié)合位點。該DNA序列在相關(guān)生物系統(tǒng)中是重要的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。靶DNA序列特異的結(jié)合蛋白(BDPX)與Gal4P的激活結(jié)構(gòu)域可融合形成融合體，BDPX與其特異DNA結(jié)合位點之間通過相互作用可激活作為表型選擇性標(biāo)志的報告基因的表達(dá)。當(dāng)前第39頁\共有57頁\編于星期六\9點酵母單雜交系統(tǒng)原理理論上，酵母單雜交系統(tǒng)可利用靶DNA序列，捕獲具有與該元件特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)不僅適用于識別轉(zhuǎn)錄因子，也適用于研究參與轉(zhuǎn)錄抑制和DNA復(fù)制過程的蛋白質(zhì)。當(dāng)前第40頁\共有57頁\編于星期六\9點酵母單雜交系統(tǒng)應(yīng)用①確定已知DNA-蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。②分離編碼結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點蛋白的新基因。③定位已經(jīng)證實的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及準(zhǔn)確定位與DNA結(jié)合的核苷酸序列。

----研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用當(dāng)前第41頁\共有57頁\編于星期六\9點(二)反向酵母雙雜交系統(tǒng)

（reverseyeasttwo-hybridsystem）1996年，Vidal等人建立了反向酵母雙雜交系統(tǒng)VidalM,BrachmannRK,FattaeyA,HarlowE,BoekeJD.Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions.ProcNatlAcadSciUSA，1996，93(19):10315-10320.當(dāng)前第42頁\共有57頁\編于星期六\9點(二)反向酵母雙雜交系統(tǒng)

（reverseyeasttwo-hybridsystem）該系統(tǒng)是一項鑒定阻斷蛋白間相互作用的技術(shù)，核心在于構(gòu)建一種反向篩選的報告基因。在這系統(tǒng)中，野生型BD-X/AD-Y間的相互作用激活一種毒性標(biāo)志作為報告基因，對酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的陰性篩選。在此情況下BD-X/AD-Y作用的解離賦予酵母一種選擇生長優(yōu)勢。利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因、解離肽或相關(guān)的小分子物質(zhì)。當(dāng)前第43頁\共有57頁\編于星期六\9點反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖當(dāng)前第44頁\共有57頁\編于星期六\9點反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖雙雜交產(chǎn)生的相互作用激活Tet阻遏蛋白，從而抑制陽性篩選標(biāo)志His3的表達(dá)，此時野生型相互作用使宿主細(xì)胞表現(xiàn)為組氨酸營養(yǎng)缺陷型。當(dāng)前第45頁\共有57頁\編于星期六\9點反向酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用用于篩選缺陷等位基因的研究：在穩(wěn)定、全長及能夠形成正確蛋白質(zhì)折疊的條件下，已有了幾種遺傳學(xué)策略來篩選作用缺陷性等位基因。在反式作用解離分子方面的應(yīng)用

在蛋白質(zhì)組研究方面的應(yīng)用：利用反向雙雜交系統(tǒng)對文庫進(jìn)行預(yù)清除，則可能大大減輕以后的假陽性鑒定工作。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補充，提出了創(chuàng)建整個有機(jī)體蛋白質(zhì)連鎖圖譜的設(shè)想。當(dāng)前第46頁\共有57頁\編于星期六\9點酵母雙雜交GAL4系統(tǒng)篩選cDNA文庫實驗流程當(dāng)前第47頁\共有57頁\編于星期六\9點GAL系統(tǒng)所用酵母菌株注：