細(xì)菌超廣譜β內(nèi)酰胺酶與耐藥性

細(xì)菌超廣譜β－內(nèi)酰胺酶與耐藥性1、什么是β－內(nèi)酰胺類抗生素？2、什么是β－內(nèi)酰胺酶？3、什么是超廣譜β－內(nèi)酰胺酶？4、它們與細(xì)菌耐藥有什么關(guān)系？當(dāng)前第1頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)一、β－內(nèi)酰胺類抗生素青霉素發(fā)現(xiàn)者、英國(guó)科學(xué)家弗萊明（1928）（一）概念

β-內(nèi)酰胺類抗生素（β-lactams）指化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素。當(dāng)前第2頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)當(dāng)前第3頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)當(dāng)前第4頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)當(dāng)前第5頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)(二)β－內(nèi)酰胺類抗生素抑制細(xì)菌的機(jī)理N-乙酰葡萄糖胺雙糖十肽轉(zhuǎn)肽酶

N-乙酰胞壁酸五肽聚合物（PBPs）粘肽（構(gòu)成細(xì)胞壁）β－內(nèi)酰胺類抗生素（－）胞漿內(nèi)細(xì)胞膜細(xì)胞膜外當(dāng)前第6頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)當(dāng)前第7頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)細(xì)胞壁合成受阻，細(xì)胞壁缺損，外環(huán)境水分滲入到菌體，菌體膨脹裂解而死。當(dāng)前第8頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)當(dāng)前第9頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)二、β－內(nèi)酰胺酶（一）概念

β-內(nèi)酰胺酶（β-lactamase）是細(xì)菌產(chǎn)生的可水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的酶。

絕大多數(shù)常見的β-內(nèi)酰胺酶有一個(gè)依賴絲氨酸發(fā)揮作用的機(jī)制。通常它們的活性位點(diǎn)具有一個(gè)狹窄的縱形溝狀結(jié)構(gòu)，在溝的底部形成了一個(gè)空腔（氧陰離子袋），這種疏松的構(gòu)造容易彎曲，便于結(jié)合底物。當(dāng)前第10頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)（二）、β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌耐藥的機(jī)理絲氨酸的結(jié)構(gòu)式當(dāng)前第11頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)

β-內(nèi)酰胺環(huán)上的羰基碳在結(jié)合β內(nèi)酰胺酶活性部位的絲氨酸時(shí)發(fā)生了不可逆的反應(yīng)，結(jié)果使其成為開環(huán)物。當(dāng)前第12頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)（三）β-內(nèi)酰胺酶分類方法一、Bush-M-J分類法（功能分類法）根據(jù)β-內(nèi)酰胺酶的功能相似性（底物和抑制物的輪廓）分為1，2，3，4四組，其中2組和3組又分為很多亞組。二、Ambler分類法（分子分類法）根據(jù)酶的氨基酸序列的保守性和相似性將β-內(nèi)酰胺酶分為A，B，C，D四組。當(dāng)前第13頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)克拉維酸當(dāng)前第14頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)

三、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

（一）概念

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extendedspectrumbeta-lactamases,ESBLs)是由質(zhì)粒介導(dǎo)的能賦予細(xì)菌對(duì)多種β-內(nèi)酰胺類抗生素和單酰胺環(huán)類抗生素耐藥并可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制的一類β-內(nèi)酰胺酶.

當(dāng)前第15頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)(二)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶特點(diǎn)（1）主要是有質(zhì)粒介導(dǎo)

ESBLs基因由質(zhì)粒介導(dǎo),可通過接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等形式在細(xì)菌間擴(kuò)散。當(dāng)前第16頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)（2）產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶主要是革蘭氏陰性菌如：大腸埃希菌屬、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌（3）能被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制如：CA（克拉維酸）、甲氧西林當(dāng)前第17頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)（1）TEM型ESBLs

TEM型ESBLs由TEM-1衍化而來。在TEM家族中

TEM-3是第一個(gè)顯示ESBLs特點(diǎn)的TEM型β-內(nèi)酰胺酶。TEM型ESBLs的形成是因?yàn)?38位甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸所形成的。這種突變提高了對(duì)頭孢噻肟的水解能力。2005年發(fā)現(xiàn)的TEM-94發(fā)生了104,238氨基酸位點(diǎn)的改變,藥敏實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對(duì)頭孢泊肟和頭孢噻肟耐藥。當(dāng)前第18頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)（三）超廣譜內(nèi)酰胺酶類型

目前發(fā)現(xiàn)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶種類已超過200多種,其類型可以分為TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型、其它型等5類。其中TEM和SHV型酶是臨床上較常見的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶。當(dāng)前第19頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)（2）SHV型ESBLs

SHV型ESBLs是由SHV-1衍化而來。SHV家族中第一個(gè)SHV型ESBLs是SHV-2。SHV-2發(fā)生了Gly-238-Ser位點(diǎn)的突變,這增加了對(duì)氧亞氨基類抗生素的親和力和水解能力。對(duì)比其它的SHV型ESBLs氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),氨基酸的突變主要集中在179,238,240,205位點(diǎn)。

當(dāng)前第20頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)

（三）ESBLs的檢測(cè)方法

1、標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法（1）表型初篩試驗(yàn)

按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法操作，當(dāng)下述抗菌藥物的抑菌環(huán)直徑頭孢泊肟(10μg)≤17mm或頭孢他啶(30μg)≤22mm或氨曲南(30μg)≤27mm或頭孢噻肟(30μg)≤27mm或頭孢曲松(30μg)≤25mm時(shí)，提示為可疑產(chǎn)ESBLs菌株。當(dāng)前第21頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)（2）表型確證試驗(yàn)

使用頭孢他啶(30μg)和頭孢他啶/克拉維酸(30/10μg)及頭孢噻肟(30μg)和頭孢噻肟/克拉維酸(30/10μg)兩對(duì)藥敏紙片，當(dāng)兩個(gè)藥物中有任何一個(gè)在加克拉維酸后抑菌環(huán)直徑與不加克拉維酸的抑菌環(huán)相比增大值≥5mm，可確認(rèn)為產(chǎn)ESBLs菌株。當(dāng)前第22頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)頭孢他啶\克拉維酸頭孢噻肟頭孢他啶頭孢噻肟\克拉維酸當(dāng)前第23頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)2三相水解試驗(yàn)區(qū)分菌株為產(chǎn)ESBLs或產(chǎn)頭孢菌素酶（AmpC酶）ESBLs和AmpC酶同時(shí)產(chǎn)生的情況。當(dāng)前第24頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)①號(hào)槽：酶粗提物；②號(hào)槽：酶+CA；③號(hào)槽：酶+氯唑西林（CLO）；④號(hào)槽：酶+CA+CLO單產(chǎn)ESBLs菌株當(dāng)前第25頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)①號(hào)槽：酶粗提物；②號(hào)槽：酶+CA；③號(hào)槽：酶+氯唑西林（CLO）；④號(hào)槽：酶+CA+CLO聯(lián)合產(chǎn)ESBLs和AmpC菌株當(dāng)前第26頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)3、E-test法

E-test，為ABBIODISK公司開發(fā)的測(cè)試ESBLs的試劑條。應(yīng)用表型確證試驗(yàn)的原理，將頭孢他啶（或頭孢噻肟）和復(fù)方制劑頭孢他啶/克拉維酸（或頭孢噻肟/克拉維酸）分別置于試條兩端，將試條貼于接種了待測(cè)細(xì)菌的平板上，刻度面朝上，35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)后，讀取試條兩端的MIC值。當(dāng)頭孢他啶與頭孢他啶/克拉維酸（或頭孢噻肟與頭孢噻肟/克拉維酸）的比值≥8時(shí)，即可判定為產(chǎn)ESBLs，否則為陰性。當(dāng)前第27頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)當(dāng)前第28頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)當(dāng)前第29頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)4、分子生物學(xué)檢測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

參照GenBank已發(fā)表的TEM、SHV、CTX-M和OXA各亞型的基因序列，分別設(shè)計(jì)特異性引物當(dāng)前第30頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)5、總結(jié)ESBLs的檢測(cè)方法表型初篩試驗(yàn)初步判斷表型確證試驗(yàn)最終確認(rèn)三相水解試驗(yàn)確認(rèn)菌株是否只產(chǎn)ESBLsE-test法分子生物學(xué)檢測(cè)當(dāng)前第31頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)（四）ESBLs的防治(1)開發(fā)能夠相對(duì)或絕對(duì)能夠抵抗β－內(nèi)酰胺酶水解的新型抗菌藥物。(2)應(yīng)用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(3)規(guī)范抗生素的使用當(dāng)前第32頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)（一）β-內(nèi)酰胺酶抑制劑β-內(nèi)酰胺酶抑制劑是一種β-內(nèi)酰胺類藥物，可與β-內(nèi)酰胺酶發(fā)生牢固的結(jié)合而使酶失活，和其他抗生素聯(lián)用可增強(qiáng)抗菌活性，減少其用量。當(dāng)前第33頁\共有35頁\編于星期四\10點(diǎn)（