第六章檸檬酸發(fā)酵過程無菌空氣制備及染菌分析和防治

第六章檸檬酸發(fā)酵過程無菌空氣制備及染菌分析和防治第一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)檸檬酸發(fā)酵的滅菌工作

一、滅菌要求與滅菌方法

檸檬酸發(fā)酵要求全過程進(jìn)行純種培養(yǎng)，即只允許檸檬酸生產(chǎn)菌的存在、生長和繁殖。特別在斜面培養(yǎng)、麩曲菌種、種子罐培菌以及發(fā)酵早期更要嚴(yán)格保證純培養(yǎng)。第二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一（一）滅菌與消毒

滅菌是指采用強(qiáng)烈的理化因素使被處理的物體內(nèi)、外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長、繁殖能力的措施。

消毒是指用理化方法消滅致病菌，即采用一定措施殺死被處理物體表面或內(nèi)部存在的對人體有害的病原菌，而并不一定是殺死一切微生物，它允許對人體無害的微生物存在。第三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一（二）滅菌方法1、火焰灼燒滅菌

接種針、鑷子等金屬小工具和玻璃棒、試管口、三角瓶口等可直接用火焰灼燒而殺死其中各種微生物。此法簡單有效，但局限性大。2、干熱滅菌

培養(yǎng)皿、吸管等玻璃器皿，可用烘箱進(jìn)行干熱滅菌。100℃，1h可殺死營養(yǎng)體細(xì)胞，而殺死芽孢則需要160℃，2h。第四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一3、濕熱滅菌常壓間歇蒸汽滅菌產(chǎn)壓下蒸汽溫度只能達(dá)到100℃，1次滅菌難以殺死各種芽孢，故可采用間歇多次滅菌法。

具體操作：用蒸汽蒸煮培養(yǎng)基30-60min，殺死微生物的營養(yǎng)體細(xì)胞，冷卻后置37℃烘箱培養(yǎng)，使未被殺死的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體。次日再蒸煮一次，37℃培養(yǎng)24h，如此反復(fù)處理3次，即可完全殺死培養(yǎng)基中的各種雜菌。第五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一加壓蒸汽滅菌

斜面、麩曲、搖瓶培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)基等都采用加壓蒸汽滅菌。

小件物品的滅菌是在加壓鍋內(nèi)進(jìn)行，鍋內(nèi)蒸汽壓力為0.1MPa，溫度120℃，以溫度為準(zhǔn)維持15~30min,能殺死各種微生物及其芽孢。

第六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一4、輻射滅菌紫外輻射滅菌

此法常用于無菌室的滅菌。波長265~266nm的紫外光對細(xì)胞有極強(qiáng)的殺傷作用。照射15~30min，可殺死大部分細(xì)菌，但紫外線穿透力極差，一層紙就能完全阻擋其輻射作用。電離輻射滅菌

60Co、X射線等電離輻射有較強(qiáng)的殺菌能力，且穿透力強(qiáng)，能殺死包裝內(nèi)各種微生物。第七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一（三）常用消毒劑

除了巴斯德或蒸汽消毒等方法外，更多的是使用化學(xué)消毒劑，在廠區(qū)周圍環(huán)境、車間地面、接種室以及皮膚表面進(jìn)行消毒。第八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一幾種常用的表面消毒劑類型名稱常用濃度/%應(yīng)用范圍作用機(jī)理醇類乙醇70~75皮膚，器皿蛋白質(zhì)變性，損傷細(xì)胞膜，脫水，溶解脂類醛類甲醛戊二醛0.5~1.02接種箱、物品、曲房接種室、精密儀器破壞蛋白質(zhì)氫鍵或氨基同上氧化劑高錳酸鉀過氧乙酸0.10.2~0.5皮膚、水果、蔬菜皮膚、器皿、玻璃電極氧化蛋白質(zhì)活性基團(tuán)同上鹵素類漂白粉碘酒10~202.5廠房、廁所、飲水、空氣、皮膚皮膚酶失活、破壞蛋白質(zhì)或細(xì)胞膜同上表面活性劑新潔爾滅杜滅酚0.05~0.10.05~0.1皮膚、器皿、桌面皮膚、金屬蛋白質(zhì)變性，損傷細(xì)胞膜同上酚類石碳酸來蘇兒3~52地面、桌面、器皿皮膚、器皿蛋白質(zhì)變性，損傷細(xì)胞膜同上酸類醋酸5~10ml/m3房間消毒（防呼吸道傳染）破壞蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜重金屬類升汞紅汞0.05~0.12器皿皮膚作用蛋白質(zhì)巰基同上第九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一二、檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌

培養(yǎng)基滅菌可分為實(shí)消和連消兩種。分批滅菌（實(shí)消）：將培養(yǎng)基置于反應(yīng)器中用蒸汽加熱，達(dá)到預(yù)定滅菌溫度后維持一定時間，再冷卻到發(fā)酵溫度的過程稱為分批滅菌。特點(diǎn)：無需專一滅菌設(shè)備，操作簡單，大容量發(fā)酵罐升降溫時間長，營養(yǎng)成分易遭到破壞，高峰蒸汽負(fù)荷大，發(fā)酵罐利用率低，耗熱量大。

適用于固體培養(yǎng)基、小型發(fā)酵罐的液體培養(yǎng)基、容易產(chǎn)生泡沫的培養(yǎng)基的消毒滅菌。第十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一連續(xù)滅菌（連消）：將培養(yǎng)基在罐外連續(xù)進(jìn)行加熱、維持和冷卻，最后進(jìn)入到反應(yīng)器的滅菌方法稱為連續(xù)滅菌。特點(diǎn)：

需要專門的滅菌設(shè)備，高溫瞬間滅菌，能使培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的破壞減小到最低程度，高峰蒸汽負(fù)荷低且均衡，發(fā)酵罐利用率高，耗熱量小、滅菌質(zhì)量好。

適用于大容量發(fā)酵罐和連續(xù)自控操作。具體操作可參考噴射液化工藝，連消之前要進(jìn)行空罐滅菌。

第十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一連續(xù)滅菌工藝流程第十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)無菌空氣的制備

檸檬酸深層發(fā)酵時利用溶解于溶液中的氧，其來源則是通過壓縮機(jī)提供的壓縮空氣。

自然界的空氣是帶塵和細(xì)菌的空氣，且通過壓縮機(jī)壓縮和管道疏通，增加了水、油污、金屬屑等雜物，因此進(jìn)入發(fā)酵罐的空氣，必須是通過適當(dāng)方法處理后的干凈、無菌空氣。目前檸檬酸發(fā)酵采用介質(zhì)過濾制備無菌空氣。第十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一一、空氣中微生物的分布情況

存在于空氣中的微生物主要有細(xì)菌、細(xì)菌芽孢、霉菌孢子、霉菌、酵母和病毒粒子。微生物一般是附著在空氣中的塵粒上。因此除去空氣中的塵埃和水、汽等，也即除去空氣中存在的各種微生物。

空氣中微生物的數(shù)量隨環(huán)境、氣候諸因子而變化。一般認(rèn)為空氣中微生物含量約在103~104個/m3。

第十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一二、檸檬酸發(fā)酵對無菌空氣的質(zhì)量要求“無菌空氣”是指通過凈化處理使空氣中含菌量降低到一定極限，因而能控制發(fā)酵污染至極小機(jī)率的空氣。

發(fā)酵的生產(chǎn)菌種和產(chǎn)品不同，對無菌空氣的質(zhì)量要求也稍有差異。第十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一檸檬酸發(fā)酵可以不考慮噬菌體的危害問題。深層發(fā)酵對培養(yǎng)基滅菌和無菌空氣的除菌要求，都是按照染菌機(jī)率為10-3的依據(jù)來設(shè)計(jì)。因?yàn)橐话慵?xì)菌繁殖一代只需20～30min，若有一個細(xì)菌進(jìn)入發(fā)酵罐，15h后可繁殖109個/ml,這足以使發(fā)酵受到嚴(yán)重影響。

黑曲霉生長迅速，正常條件下很快進(jìn)入產(chǎn)酸期，使培養(yǎng)基pH下降，增強(qiáng)了抗污染能力，按上述常規(guī)要求設(shè)計(jì)所得到的無菌空氣，可以滿足檸檬酸發(fā)酵要求。第十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一三、空氣預(yù)處理流程

空氣凈化處理的目的是除菌，然而目前使用的過濾介質(zhì)必須在干燥條件下工作才能保證除菌效率，因此空氣需要預(yù)處理以除去油污、水和較大的顆粒?？諝鈨艋鞒痰倪x擇應(yīng)環(huán)繞著提高除菌效率進(jìn)行。第十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一

提高除菌效率的主要措施：減少進(jìn)口空氣的含菌數(shù)，其方法為：加強(qiáng)衛(wèi)生場地的衛(wèi)生管理，減少生產(chǎn)環(huán)境中含菌數(shù)；正確選擇進(jìn)風(fēng)口，一般空壓站應(yīng)在生產(chǎn)車間的上風(fēng)向；提高進(jìn)口空氣位置；加強(qiáng)壓縮前預(yù)處理。設(shè)計(jì)和安裝合理的空氣過濾器，選用除菌效率高的過濾介質(zhì)。設(shè)計(jì)合理的空氣與處理設(shè)備。降低進(jìn)入空氣過濾器的空氣的相對濕度，保證過濾介質(zhì)在干燥狀態(tài)下工作，其方法是：采用無油空壓機(jī)；加強(qiáng)空氣冷卻和去油、水；提高進(jìn)入過濾器的空氣溫度，降低相對濕度。第十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一

以上措施的具體做法應(yīng)根據(jù)具體情況而定：1、將壓縮空氣冷卻至露點(diǎn)以上，使其相對濕度為60~70%以下，然后進(jìn)入過濾器（圖一）。這種流程適用于北方和內(nèi)陸氣候干燥地區(qū)。此流程簡單，但要求進(jìn)口空氣的絕對濕含量不能太高，否則冷卻后的壓縮空氣相對濕度為60%時的溫度就會很高。（圖一）將空氣冷卻至露點(diǎn)以上的流程1、高空采風(fēng)；2、粗過濾器；3、空壓機(jī)；4、冷卻器；5、貯氣罐；6、空氣總過濾器；7、空氣分過濾器第十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一2、將壓縮空氣冷卻至露點(diǎn)以下，析出部分水分，然后升溫使相對濕度下降至60%左右，再進(jìn)入空氣過濾器。

根據(jù)氣候情況有一次冷卻一次析水流程（圖二）和二次冷卻二次析水流程（圖三）。這兩種流程適用于空氣中濕含量較大的南方沿海地區(qū)。第二十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一

(圖二)一次冷卻一次析水的的空氣凈化流程1、高空采風(fēng)；2、粗過濾器；3、空壓機(jī)；4、冷卻器；5.6、析水器7、貯氣罐；8、加熱器；9、總過濾器；10、分過濾器第二十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一

（圖三）二次冷卻二次析水的空氣預(yù)處理流程1、高空采風(fēng)；2、粗過濾器；3、空壓機(jī)；4.6、冷卻器；5.7、析水器8、貯氣罐；9、加熱器；10、空氣總過濾器；11、空氣分過濾器第二十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一3、利用壓縮后的熱空氣與冷卻后的冷空氣進(jìn)行熱交換，使冷卻空氣溫度升高，降低相對濕度（圖四）。此流程對熱能利用較合理，熱交換器還兼做貯氣罐，但由于氣-氣換熱的傳熱系數(shù)很小，加熱面積要足夠大。第二十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一

（圖四）利用熱空氣加熱冷空氣的流程1、高空采風(fēng)；2、粗過濾器；3、空壓機(jī)；4、熱交換器；5、冷卻器；6.7、析水器；8、總過濾器；9、分過濾器第二十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一4、將壓縮后的空氣部分冷卻析水，另一部分的熱空氣直接與冷卻析水后的空氣混合，然后進(jìn)入空氣過濾器（圖五）。

此流程適用于空氣的濕含量中等的地區(qū)。其對熱能的利用合理，但操作要求高，要根據(jù)不同氣候調(diào)節(jié)兩部分空氣的混合比。第二十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一

（圖五）冷熱空氣直接混合的空氣凈化流程1、高空采風(fēng)；2、粗過濾器；3、空壓機(jī)；4、冷卻器；5.6、析水器；7、貯氣罐；8、總過濾器；9、分過濾器第二十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一四、介質(zhì)過濾空氣除塵原理

用介質(zhì)從空氣中除菌的方法可分為兩大類：同從液相中除去固相顆粒一樣，所用過濾介質(zhì)的孔徑小于微粒的直徑，此法過濾效果可達(dá)100%的完全除菌程度，但很不經(jīng)濟(jì)，不適用于處理發(fā)酵工業(yè)用的大量無菌空氣。第二十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一各種纖維介質(zhì)過濾器和金屬、塑料、石墨、陶瓷等粉末燒結(jié)而成的微孔過濾器。

理論上纖維介質(zhì)過濾不能達(dá)到絕對除菌效果，因?yàn)槔w維形成的網(wǎng)格空隙遠(yuǎn)大于空氣中塵埃的粒徑。但是纖維介質(zhì)是由許許多多的纖維充填在一起，組成了一個有一定厚度而又孔道曲折的多層截留結(jié)構(gòu)。因此，當(dāng)塵粒穿過介質(zhì)層時經(jīng)多次阻擋而被截留，從而達(dá)到發(fā)酵工業(yè)所需無菌空氣的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單、體積小、壓力降小和運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用低等。第二十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一五、檸檬酸發(fā)酵常用空氣過濾器

發(fā)酵工業(yè)用的空氣過濾器有兩種組合：一種是由一臺總過濾器與多臺發(fā)酵罐的分過濾器組合；另一種是各發(fā)酵罐單獨(dú)設(shè)置預(yù)過濾器和精過濾器的組合。顯然后者優(yōu)于前者，特別在空氣系統(tǒng)發(fā)生污染事故時，可分別處理而不影響生產(chǎn)。

第二十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一棉花過濾器常稱為總過濾器。過濾介質(zhì)通常采用未脫脂的棉花和棒狀活性炭。超細(xì)玻璃纖維紙過濾器，多作為分過濾器使用。一般采用質(zhì)量較好的無堿玻璃纖維制成的紙。維尼綸纖維過濾器：結(jié)構(gòu)簡單，過濾效果好，機(jī)械強(qiáng)度高，壓力降小，使用壽命長，操作方便。但不耐熱，故不能滅菌。使用前先用40℃的熱空氣對濾層吹10h以上。第三十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一六、無菌空氣制備系統(tǒng)流程和要求空氣凈化系統(tǒng)的設(shè)備功能，在過濾器之前是脫油、除濕，保證潔凈干燥的空氣進(jìn)入過濾器濾層之后除去了空氣的雜菌。只有保持濾層的干燥和完好，才能達(dá)到除菌的目的，因此除濕、脫油設(shè)備是不可缺少的。第三十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一兩級冷卻、加熱除菌流程示意圖1.粗過濾器2.壓縮機(jī)3.貯罐4、6.冷卻罐

5.旋風(fēng)分離器7.絲網(wǎng)分離器8.加熱器9.過濾器第三十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一七、無菌空氣的檢查肉湯培養(yǎng)基檢查法：

在分過濾器空氣出口端的管道支管的小考克上用橡皮管與一只裝有250ml肉湯培養(yǎng)基的三角瓶連接，少許打開小考克使空氣進(jìn)入肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，連續(xù)數(shù)小時或十幾小時，小心卸下橡皮管，用無菌紙包扎好管的末端，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h，若出現(xiàn)渾濁，表明空氣中有雜菌。

此法所測定的空氣體積與進(jìn)入發(fā)酵罐空氣體積之比懸殊太大，兼之生物測定操作繁瑣，測定結(jié)果較難反映出真實(shí)情況。第三十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一檢查無菌空氣裝置示意圖第三十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一光學(xué)檢查法：

此法原理是利用微粒對光線的散射作用來測量空氣中粒子大小和數(shù)量。

常用的檢測儀器為Y09-1型粒子計(jì)數(shù)器。測量時以一定速度將試樣空氣通過檢測區(qū)，同時用聚光透鏡將光源來的光線聚成強(qiáng)烈光束射入檢測區(qū)，由于空氣受到光線強(qiáng)烈照射，空氣中的微粒把光線散射出去，由聚光透鏡將散射光聚集投入光電倍增管，將光轉(zhuǎn)換成電訊號，經(jīng)自動計(jì)數(shù)器計(jì)算出粒子的大小與數(shù)量。第三十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第三節(jié)、檸檬酸深層發(fā)酵染菌分析及防治（一）檸檬酸發(fā)酵常見的污染菌

檸檬酸發(fā)酵初期，即發(fā)酵液pH>3.0時，常見的污染菌有細(xì)菌、酵母、曲霉及青霉菌等，隨著發(fā)酵液pH的下降，大多數(shù)細(xì)菌和曲霉菌被抑制或自溶，而耐酸性的酵母和青霉菌等則繼續(xù)繁殖，重者導(dǎo)致發(fā)酵倒罐，輕者產(chǎn)酸很低且粘度增加，提取困難。第三十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一常見的污染菌有以下幾種：A、細(xì)菌：產(chǎn)氣桿菌、琥珀酸菌、熒光桿菌等；B、酵母：釀酒醭酵母、葡萄酒醭酵母、清酒酵母等；C、霉菌：米曲霉、泡盛酒曲霉、皺褐青霉等。第三十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一（二）污染菌的檢查1、感官檢查大部分被污染的發(fā)酵液可以從發(fā)酵液的異常情況來檢查，如色度、異味、變稠或稀、生產(chǎn)菌球體散開。菌絲變形、產(chǎn)酸不正常、而糖卻大量消耗等。

借助顯微鏡可以檢出細(xì)菌、酵母菌、曲霉、青霉的菌體形態(tài)。第三十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一2、平板劃線檢查凡是認(rèn)為染菌罐，或發(fā)酵不正常而未確準(zhǔn)的染菌罐，都必須做平板劃線檢查，以便最終確認(rèn)是否染菌，染什么菌，作為生產(chǎn)者采取搶救、補(bǔ)救以及消除隱患等措施的依據(jù)。如細(xì)菌污染可用肉汁瓊脂平板或肉湯培養(yǎng)檢出。酵母、曲霉、青霉污染，可用米曲汁或麥芽汁瓊脂平板劃線檢出。

為了及時處理染菌事故，生產(chǎn)上以感官為主，平板劃線則是指導(dǎo)制定防止染菌措施的主要依據(jù)。第三十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一3、無菌樣和對照樣培養(yǎng)基滅菌后的無菌取樣，斜面菌種、麩曲菌種、二級菌種以及接種后的發(fā)酵液搖瓶對照樣是發(fā)酵管理工作中一項(xiàng)必需的重要工作。

發(fā)酵染菌有前期和后期之分，有操作不慎和菌種污染之別等。而無菌樣和對照樣是查找原因、分清責(zé)任、有的放矢、采取措施的重要依據(jù)之一。第四十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一（三）染菌的原因分析1、染菌的一般規(guī)律發(fā)酵染菌的一般規(guī)律第四十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一2、染菌的主要因素

發(fā)酵工業(yè)染菌的主要原因不外乎環(huán)境惡化、空氣凈化系統(tǒng)失效、設(shè)備及管道閥門穿孔或滲漏、種子帶菌、操作不當(dāng)和管理不嚴(yán)等方面。

可以從染菌期來判斷染菌的原因：A.早期染菌：染菌因素可能是種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、接種操作不當(dāng)，發(fā)酵罐內(nèi)有死角或嚴(yán)重滲漏、空氣凈化系統(tǒng)嚴(yán)重失效，即雜菌從發(fā)酵開始就進(jìn)入或遺留在發(fā)酵培養(yǎng)基中。B.中、后期染菌：多數(shù)是由于空氣凈化不良、培養(yǎng)基滅菌時發(fā)生“瀑料”、培養(yǎng)時泡沫