第八微生物的遺傳與變異演示文稿

第八微生物的遺傳與變異演示文稿當前第1頁\共有117頁\編于星期五\22點（優(yōu)選）第八微生物的遺傳與變異當前第2頁\共有117頁\編于星期五\22點研究微生物遺傳的意義微生物的獨特生物學(xué)特性：（1） 個體的體制極其簡單；（2） 營養(yǎng)體一般都是單倍體；（3） 易于在成分簡單的組合培養(yǎng)基上大量生長繁殖；（4） 繁殖速度快；（5） 易于積累不同的中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物；（6） 菌落形態(tài)特征的可見性和多樣性；（7） 環(huán)境條件對微生物群體中各個個體作用的直接性和均一性；（8） 易于形成營養(yǎng)缺陷型；（9） 各種微生物一般都有相應(yīng)的病毒；（10） 存在多種處于進化過程中的原始有性生殖方式；當前第3頁\共有117頁\編于星期五\22點微生物是研究現(xiàn)代遺傳學(xué)和其它許多主要的生物學(xué)基本理論問題中最熱衷的研究對象。對微生物遺傳規(guī)律的深入研究，不僅促進了現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物工程學(xué)的發(fā)展，而且為育種工作提供了豐富的理論基礎(chǔ)，促使育種工作從不自覺到自覺、從低效到高效、從隨機到定向、從近緣雜交到遠緣雜交的方向發(fā)展。研究微生物遺傳學(xué)的意義當前第4頁\共有117頁\編于星期五\22點第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)種質(zhì)連續(xù)理論：1883~1889年間Weissmann提出。認為遺傳物質(zhì)是一種具有特定分子結(jié)構(gòu)的化合物。基因?qū)W說：二十世紀初發(fā)現(xiàn)了染色體并提出基因?qū)W說，使得遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的范圍縮小到染色體上。染色體由核酸和蛋白質(zhì)兩種長鏈高分子組成。20多種氨基酸經(jīng)過不同排列組合，可以演變出的蛋白質(zhì)數(shù)目幾乎可以達到一個天文數(shù)字，而核酸的組成卻簡單得多，一般僅由4種不同的核苷酸組成，它們通過排列組合只能產(chǎn)生較少種類的核酸，因此當時認為決定生物遺傳型的染色體和基因，起活性成分是蛋白質(zhì)。DNA是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)的證明：1944年以后，利用微生物為實驗對象進行的三個著名實驗（肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗、噬菌體感染試驗、病毒的拆開與重建試驗）當前第5頁\共有117頁\編于星期五\22點1928年，Griffith進行了以下幾組實驗：（1）動物實驗

對小鼠注射活R菌或死S菌————小鼠存活

對小鼠注射活S菌————————小鼠死亡

對小鼠注射活R菌和熱死S菌———小鼠死亡抽取心血分離活的S菌

一、三個經(jīng)典實驗（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗（transformation）：F.Griffith，研究對象：Streptococcuspneumoniae（肺炎雙球菌）S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有莢膜R型菌株：無致病性，菌落表面粗糙，無莢膜當前第6頁\共有117頁\編于星期五\22點（2）細菌培養(yǎng)實驗

熱死S菌—————不生長

活R菌—————長出R菌

熱死S菌+活R菌—————長出大量R菌和10-6S菌（3）S型菌的無細胞抽提液試驗

活R菌+S菌無細胞抽提液————長出大量R菌和少量S菌以上實驗說明：加熱殺死的S型細菌細胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過某種方式進入R型細胞并使R型細胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀當前第7頁\共有117頁\編于星期五\22點①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白質(zhì)⑥加S菌的莢膜多糖活R菌長出S菌只有R菌1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty從熱死S型S.pneumoniae中提純了可能作為轉(zhuǎn)化因子的各種成分，在離體條件下進行了轉(zhuǎn)化試驗：只有S型細菌的DNA才能將S.Pneumoniae的R型轉(zhuǎn)化為S型。且DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率也越高。說明S型菌株轉(zhuǎn)移給R型菌株的，是遺傳因子。當前第8頁\共有117頁\編于星期五\22點（二）噬菌體感染實驗A.D.Hershey和M.Chase，1952年（1）含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中（2）含35S-蛋白質(zhì)的一組：放射性75%在上清液中所以，進入細胞的是噬菌體的核酸而不是蛋白質(zhì)。當前第9頁\共有117頁\編于星期五\22點（三）植物病毒的重建實驗為了證明核酸是遺傳物質(zhì)，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的煙草花葉病毒（TMV）進行了著名的植物病毒重建實驗。將TMV在一定濃度的苯酚溶液中振蕩，就能將其蛋白質(zhì)外殼與RNA核心相分離。分離后的RNA在沒有蛋白質(zhì)包裹的情況下，也能感染煙草并使其患典型癥狀，而且在病斑中還能分離出正常病毒粒子。當前第10頁\共有117頁\編于星期五\22點選用TMV和霍氏車前花葉病毒（HRV），分別拆分取得各自的RNA和蛋白質(zhì)，將兩種RNA分別與對方的蛋白質(zhì)外殼重建形成兩種雜合病毒：（1）RNA（TMV）-蛋白質(zhì)（HRV）（2）RNA（HRV）-蛋白質(zhì)（TMV）用兩種雜合病毒感染寄主：（1）表現(xiàn)TMV的典型癥狀病分離到正常TMV粒子（2）表現(xiàn)HRV的典型癥狀病分離到正常HRV粒子。上述結(jié)果說明，在RNA病毒中，遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是核酸。當前第11頁\共有117頁\編于星期五\22點朊病毒的發(fā)現(xiàn)和思考朊病毒含有微量的核酸，仍未發(fā)現(xiàn)？朊病毒僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成朊病毒的遺傳物質(zhì)為蛋白質(zhì)？當前第12頁\共有117頁\編于星期五\22點第二節(jié)微生物的基因組結(jié)構(gòu)基因組：細胞中基因以及非基因的DNA序列的總稱，包括結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控序列以及目前功能未知的DNA序列。微生物的基因組一般較小，見P137當前第13頁\共有117頁\編于星期五\22點原核生物（大腸桿菌）的基因組緊密纏繞的環(huán)狀雙鏈DNA分子遺傳信息的連續(xù)性功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成操縱子結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因的單拷貝及rRNA基因的多拷貝基因組的重復(fù)序列少而短當前第14頁\共有117頁\編于星期五\22點真核生物（啤酒酵母）的基因組

DNA與組蛋白構(gòu)成染色體有間隔子或內(nèi)含子序列沒有明顯的操縱子結(jié)構(gòu)含有一定數(shù)量的重復(fù)序列（低度、中度和高度重復(fù)）

遺傳豐余：較高同源性的DNA重復(fù)序列當前第15頁\共有117頁\編于星期五\22點古細菌（詹氏甲烷球菌）的基因組古細菌的基因組結(jié)構(gòu)類似于細菌，即在環(huán)形DNA分子上功能相關(guān)的基因組成操縱子結(jié)構(gòu)，無內(nèi)含子序列。負責(zé)信息傳遞功能的結(jié)構(gòu)（復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯）類似于真核生物，如啟動子結(jié)構(gòu)、復(fù)制起始因子、RNA聚合酶、翻譯延伸因子等當前第16頁\共有117頁\編于星期五\22點第三節(jié)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子當前第17頁\共有117頁\編于星期五\22點原核生物的質(zhì)粒定義：是一類小型共價閉合環(huán)狀核外DNA，能獨立于細胞核進行自主復(fù)制?？梢酝ㄟ^交換摻入細胞核成為附加體；可以從寄主細胞中消除。

近年來也發(fā)現(xiàn)了線性雙鏈DNA質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒大?。?~100×106Da，含有數(shù)個到數(shù)十個甚至上百個基因。性質(zhì)：質(zhì)粒是一種復(fù)制子，分為嚴緊型和松弛型，嚴緊型質(zhì)粒的復(fù)制受細胞核控制，一般一個寄主細胞內(nèi)有2~3個；松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不受細胞核控制，在細胞內(nèi)的數(shù)量可以達到10-15個功能：進行細胞間接合并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、降解功能等。重組：在質(zhì)粒之間、質(zhì)粒與染色體之間菌可發(fā)生。當前第18頁\共有117頁\編于星期五\22點原核生物的質(zhì)粒存在范圍：很多細菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcuslactis

Agrobacteriumtumefaciensetal制備：包括增殖、裂解細胞、分離質(zhì)粒與染色體和蛋白質(zhì)等成分、去除RNA和蛋白質(zhì)等步驟。鑒定：電鏡觀察、電泳、密度梯度離心、限制性酶切圖譜等方法當前第19頁\共有117頁\編于星期五\22點幾種代表性質(zhì)粒：1.F-因子（fertilityfactor）致育因子/性因子，62×106Dalton，94.5kb，相當于核染色體DNA2%的環(huán)狀雙鏈DNA，足以編碼94個中等大小多肽，其中1/3基因（tra區(qū)）與接合作用有關(guān)。存在于腸細菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細菌中，決定性別。2.巨大質(zhì)粒（mega質(zhì)粒）為近年來在Rhizobium（根瘤菌屬）中發(fā)現(xiàn)的一種質(zhì)粒，分子量為200~300×106Dalton，比一般質(zhì)粒大幾十倍到幾百倍，故稱巨大質(zhì)粒，其上有一系列固氮基因。當前第20頁\共有117頁\編于星期五\22點3.Ti（毒性）質(zhì)粒（tumoeinducingplasmid）即誘癌質(zhì)粒。長200kb，是一種大型質(zhì)粒。存在于根癌土壤桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）中。賦予宿主引起許多雙子葉植物的根癌的特性。當帶有Ti質(zhì)粒的細菌侵入植物細胞中后，在其細胞中溶解，把細菌的DNA釋放至植物細胞中。含有復(fù)制子的Ti質(zhì)粒的小片段與植物細胞中的核染色體發(fā)生整合，破壞控制細胞分裂的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而使它轉(zhuǎn)變成癌細胞。Ti質(zhì)粒已成為植物遺傳工程研究中的重要載體。一些具有重要形狀的外源基因可借DNA重組技術(shù)設(shè)法插入到Ti質(zhì)粒中，并進一步使之整合到植物染色體上，以改變該植物的遺傳性，達到培育植物優(yōu)良品種的目的。當前第21頁\共有117頁\編于星期五\22點4.Col因子（colicinogenicfactor）產(chǎn)大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是一種由E.coli的某些菌株所分泌的細菌蛋白，具有通過抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或能量代謝等而專一地殺死不含Col因子的近緣的其它腸道細菌。凡帶Col因子的菌株，由于質(zhì)粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對大腸桿菌素有免疫作用，不受其傷害。有些G+細菌也產(chǎn)生細菌素，如用于食品保藏的NisinColE1研究得很多，并被廣泛地用于重組DNA的研究和用于體外復(fù)制系統(tǒng)上。當前第22頁\共有117頁\編于星期五\22點5.R（抗生素抗性和重金屬抗性）因子（resistencefactor）最初發(fā)現(xiàn)于痢疾志賀氏菌（Shigelladysenteriae），后來發(fā)現(xiàn)還存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。R因子由相連的兩個DNA片段組成，即抗性轉(zhuǎn)移因子（resistencetransforfactor，RTF）和抗性決定因子（r-determinant），RTF控制質(zhì)粒copy數(shù)及復(fù)制，抗性決定因子帶有抗生素或重金屬的抗性基因。R-因子在細胞內(nèi)的copy數(shù)可從1~2個到幾十個，分為嚴緊型和松弛型兩種，經(jīng)氯霉素處理后，松弛型質(zhì)?？蛇_2000~3000個/細胞。當前第23頁\共有117頁\編于星期五\22點6.降解性（代謝）質(zhì)粒如假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)。它們的降解性質(zhì)?？蔀橐幌盗心芙到鈴?fù)雜物質(zhì)的酶編碼，從而能利用一般細菌所難以分解的物質(zhì)做碳源。這些質(zhì)粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟腦）質(zhì)粒，XYL（二甲苯）質(zhì)粒，SAL（水楊酸）質(zhì)粒，MDL（扁桃酸）質(zhì)粒，，NAP（奈）質(zhì)粒和TOL（甲苯）質(zhì)粒等。當前第24頁\共有117頁\編于星期五\22點7.隱秘質(zhì)粒不顯示任何表型效應(yīng)，只能通過物理的方法檢測的質(zhì)粒。如酵母菌的2um質(zhì)粒。當前第25頁\共有117頁\編于星期五\22點40年代B.McClintock對玉米的遺傳研究而發(fā)現(xiàn)染色體易位，打破了基因是固定在染色體DNA上的一些不可移動的核苷酸片段的說法。有些DNA片段不但可在染色體上移動，而且還可從一個染色體跳到另一個染色體，從一個質(zhì)粒跳到另一個質(zhì)?；蛉旧w，甚至還可從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞。在這些DNA順序的跳躍過程中，往往導(dǎo)致DNA鏈的斷裂或重接，從而產(chǎn)生重組交換或使某些基因啟動或關(guān)閉，結(jié)果導(dǎo)致突變的發(fā)生。這似乎就是自然界所固有的“基因工程”。目前已把在染色體組中或染色體組間能改變自身位置的一段DNA順序稱為轉(zhuǎn)座因子（transposibleelement），也稱作跳躍基因（jumpinggene）或可移動基因（movablegene）。當前第26頁\共有117頁\編于星期五\22點轉(zhuǎn)座因子插入（IS）序列轉(zhuǎn)座子(Tn)特殊病毒（Mu噬菌體）定義：可在DNA鏈上改變自身位置的一段DNA序列。原核生物中的轉(zhuǎn)座子類型轉(zhuǎn)座的遺傳效應(yīng)當前第27頁\共有117頁\編于星期五\22點插入序列（IS，insertionsequence)分子量最?。▋H0.7~1.4kb），只有引起轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座酶基因而不含其它基因，具有反向末端重復(fù)序列。已在染色體、F因子等質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)IS序列。E.coli的F因子和核染色體組上有一些相同的IS，通過這些同源序列間的重組，就可使F因子插入到E.coli的核染色體組上，形成Hfr菌株。因IS在染色體組上插入的位置和方向的不同，其引起的突變效應(yīng)也不同。IS被切離時引起的突變可以回復(fù)，如果因切離部位有誤而帶走IS以外的一部分DNA序列，就會在插入部位造成缺失，從而發(fā)生新的突變。

當前第28頁\共有117頁\編于星期五\22點轉(zhuǎn)座子（Tn，transposon)轉(zhuǎn)座子又稱轉(zhuǎn)位子或易位子分子量居中（一般為2~25kb）。除了與轉(zhuǎn)座作用有關(guān)的基因外，還含有抗性基因（對抗生素、某些毒物）、乳糖發(fā)酵基因等幾個至十幾個基因。從結(jié)構(gòu)來看，Tn有兩種類型，即末端為反向或順向重復(fù)的IS，或末端為反向重復(fù)的序列。Tn雖能插到受體DNA分子的許多位點上，但并不完全是隨機的，某些區(qū)域更易插入。

當前第29頁\共有117頁\編于星期五\22點Mu噬菌體（即mutatorphage）

Mu噬菌體即誘變噬菌體是E.coli的一種溫和噬菌體。含有噬菌體生長繁殖和轉(zhuǎn)座所必需的基因，其分子量最大（39kb），含有20多個基因，但并沒有固定的整合位置。Mu噬菌體引起的轉(zhuǎn)座可以引起插入突變，其中約有2%是營養(yǎng)缺陷型突變。當前第30頁\共有117頁\編于星期五\22點轉(zhuǎn)座的遺傳效應(yīng)插入突變產(chǎn)生染色體畸變（復(fù)制性轉(zhuǎn)座子）基因的移動和重排當前第31頁\共有117頁\編于星期五\22點第四節(jié)基因突變及修復(fù)當前第32頁\共有117頁\編于星期五\22點一、基因突變基因突變（genemutation）簡稱突變，是變異的一種，指生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化。突變率常在10-8~10-9范圍內(nèi)。當前第33頁\共有117頁\編于星期五\22點(一)基因突變的類型（根據(jù)遺傳信息的變化）原序列5‘-AUGCCUUCAAGAUGUGGGMetProSerArgCysGly(1)同義突變5‘-AUGCCUUCAAGAUGUGGAMetProSerArgCysGly(2)錯義突變5‘-AUGCCUUCAGGAUGUGGAMetProSerGlyCysGly(3)無義突變5‘-AUGCCUUCAAGAUGAGGAMetProSerArg(4)移碼突變5‘-AUGCCUUCAAGU

GUGGGMetProSerSerVal當前第34頁\共有117頁\編于星期五\22點突變類型突變株的表型 成因 檢出方法營養(yǎng)缺陷型因突變而喪失合成一 補充培養(yǎng)基（auxotroph）種或幾種生長因子的 能力不能在基本培養(yǎng) 基上生長突變株抗性突變型因突變而產(chǎn)生了對某 藥物培養(yǎng)基（resistantmutant）種化學(xué)藥物或致死 物理因子的抗性條件致死突變型突變后在某種條件下培養(yǎng)條件改變（conditional可正常生長、繁殖并lethalmutant）實現(xiàn)其表型，而在另 一條件下卻無法生長 繁殖的突變型當前第35頁\共有117頁\編于星期五\22點突變株的表型 成因檢出方法形態(tài)突變型因突變而產(chǎn)生的個體 形態(tài)Morphologycal或菌落形態(tài)的非選擇（常用顏色變化）

mutant 性變異 抗原突變型因突變而引起的抗原借助于抗原antigenic結(jié)構(gòu)發(fā)生改變抗體反應(yīng)mutant 產(chǎn)量突變型因突變而獲得的在有測定產(chǎn)量或highproducing用代謝物產(chǎn)量上高于其它mutant 原始菌株的突變株 其它突變型：毒力、糖發(fā)酵能力、代謝產(chǎn)物等 當前第36頁\共有117頁\編于星期五\22點（二）突變率突變率:

每一細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。突變率為10-8是指該細胞在一億次細胞分裂中，會發(fā)生一次突變。突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示。如一個含108個細胞的群體，當其分裂為2×108個細胞時，即可產(chǎn)生一個突變表型。突變率=突變細胞數(shù)/分裂前群體細胞數(shù)突變率是獨立的。某一基因發(fā)生突變不會影響其它基因的突變率。在同一個細胞中同時發(fā)生兩個基因突變的幾率是極低的，因為雙重突變型的幾率只是各個突變幾率的乘積。當前第37頁\共有117頁\編于星期五\22點一些菌種某些性狀的自發(fā)突變率菌名突變性狀突變率EscherichiacoliE.coliE.coliE.coliStaphylococcusaureusS.aureusSalmonellatyphiBacillusmegaterium抗T1噬菌體抗T3噬菌體不發(fā)酵乳糖抗紫外線抗青霉素抗鏈霉素抗25ug/L鏈霉素抗異煙肼3×10-81×10-71×10-101×10-51×10-71×10-95×10-65×10-5當前第38頁\共有117頁\編于星期五\22點（三）突變的特點

適用于整個生物界，以細菌的抗藥性為例。

1.不對應(yīng)性：突變的性狀與突變原因之間無直接的對應(yīng)關(guān)系。

（變量試驗、涂布試驗、平板影印培養(yǎng)試驗）

2.自發(fā)性：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。

3.稀有性：突變率低且穩(wěn)定。

4.獨立性：各種突變獨立發(fā)生，不會互相影響。

5.可誘發(fā)性：誘變劑可提高突變率。

6.穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳。

7.可逆性：原始的野生基因到變異株的突變稱為正向

突變（forwardmutation），相反的過程則

稱為回復(fù)突變或回變（back

mutation或

reversemutation）。當前第39頁\共有117頁\編于星期五\22點（四）突變的機制

堿基置換（轉(zhuǎn)換顛換）點突變移碼突變（缺失添加）誘變畸變：缺失、添加、易位、倒位

自發(fā)突變突變當前第40頁\共有117頁\編于星期五\22點.誘變機制 誘變劑（mutagen）：凡能提高突變率的任何理化因子，誘變劑的種類很多，作用方式多樣。即使是同一種誘變劑，也常有不同的作用方式。當前第41頁\共有117頁\編于星期五\22點堿基置換（substitution）定義：對DNA來說，堿基的置換屬于一種染色體的微小損傷（microlesion），一般也稱點突變（pointmutation）。它只涉及一對堿基被另一對堿基所置換。分類：

轉(zhuǎn)換（transition），即DNA鏈中的一個嘌呤被另一個嘌呤或是一個嘧啶被另一個嘧啶所置換；

顛換（transversion），即一個嘌呤被另一個嘧啶或是一個嘧啶被另一個嘌呤所置換。對某一具體誘變劑來說，可同時引起轉(zhuǎn)換與顛換，也可只具其中的一種功能。根據(jù)化學(xué)誘變劑是直接還是間接地引起置換，可把置換的機制分成以下兩類來討論。當前第42頁\共有117頁\編于星期五\22點直接引起置換的誘變劑一類可直接與核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的誘變劑，例如亞硝酸、羥胺和各種烷化劑（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亞硝基胍，N-甲基-N-亞硝基脲，乙烯亞胺，環(huán)氧乙酸，氮芥等）。它們可與一個或幾個核苷酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而引起DNA復(fù)制時堿基配對的轉(zhuǎn)換，并進一步使微生物發(fā)生變異。在這些誘變劑中，除羥胺只引起G┇C→A：T外，其余都是可使G┇CA：T發(fā)生互變的。能引起顛換的誘變劑很少，只是部分烷化劑才有。

當前第43頁\共有117頁\編于星期五\22點堿基轉(zhuǎn)換的分子機制亞硝酸可使堿基發(fā)生氧化脫氨作用，故它能使腺嘌呤（A）變成次黃嘌呤（H），使胞嘧啶（C）變成尿嘧啶（U），從而發(fā)生轉(zhuǎn)換。它也可使鳥嘌呤（G）變成黃嘌呤（X），但這時不能引起轉(zhuǎn)換。其中A→H而引起的轉(zhuǎn)換過程分以下幾個環(huán)節(jié)：①腺嘌呤經(jīng)氧化脫氨后變成烯醇式次黃嘌呤（He）；②He通過自發(fā)的互變異構(gòu)效應(yīng)而形成Hk（酮式次黃嘌呤）；③DNA雙鏈第一次復(fù)制，結(jié)果Hk因其在6位上含有酮基，故只能與6位上含有氨基的胞嘧啶（C）配對；④DNA雙鏈的第二次復(fù)制，這時其中的C按常規(guī)與G配對，因而最終實現(xiàn)了轉(zhuǎn)換。當前第44頁\共有117頁\編于星期五\22點亞硝酸引起的使A︰T轉(zhuǎn)換成G┇C過程的簡式見下圖

HNO2

A:THe:THk+T第一次復(fù)制

A┇THk┇C第二次復(fù)制

G┇C

Hk┇C當前第45頁\共有117頁\編于星期五\22點間接引起置換的誘變劑引起這類變異的誘變劑都是一些堿基類似物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鳥嘌呤（8-NG）、2-氨基嘌呤（2-AP）和6-氯嘌呤（6-CP）等。它們的作用是通過細胞的代謝活動摻入到DNA分子中后而引起堿基置換，故是間接的?，F(xiàn)以5-BU為例來加以說明。

5-BU是T的代謝類似物。當把某一微生物培養(yǎng)在含5-BU的培養(yǎng)液中時，細胞中有一部分新合成的DNA的T就被5-BU所取代。5-BU一般以酮式狀態(tài)存在于DNA中，因而仍可正常地與A配對，這時并未發(fā)生堿基對的轉(zhuǎn)換。有時5-BU會以烯醇式狀態(tài)出現(xiàn)在DNA中，于是當DNA進行復(fù)制時，在其相對位置上出現(xiàn)的就是G，而不是原來的A，因而引起了堿基對從原來的A︰T變至G┇C的轉(zhuǎn)換。

當前第46頁\共有117頁\編于星期五\22點5-BU在以酮式或烯醇式狀態(tài)存在時引起的A︰T→G┇C的轉(zhuǎn)換

A:T

G:CA:TA:BukG:BueG:CG:BueA:TG:CA:BukA:BUG:C

A:TA:BU當前第47頁\共有117頁\編于星期五\22點從上圖中，還可看到5-BU的摻入引起的G┇C回復(fù)到A︰T的過程。通過這兩個圖示，就很容易理解為什么同一種誘變劑既可造成正向突變，又可使它產(chǎn)生回復(fù)突變的原因了。另外，也可以看到，為什么像5-BU這類代謝類似物只有對正在進行新陳代謝和繁殖著的微生物才起作用，而對休止細胞、游離的噬菌體粒子或離體的DNA分子卻不起作用。當前第48頁\共有117頁\編于星期五\22點移碼突變移碼突變（frame-shiftmutation）指誘變劑使DNA分子中的一個或少數(shù)幾個核苷酸的增添（插入）或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤的一類突變。由移碼突變所產(chǎn)生的突變株，稱為移碼突變株（frameshiftmutant）。與染色體畸變相比，移碼突變也只能算是DNA分子的微小損傷。

丫啶類染料，如丫啶黃、丫啶橙和α-氨基丫啶等，都是移碼突變的有效誘變劑。當前第49頁\共有117頁\編于星期五\22點丫啶類化合物的誘變機制至今還不很清楚。有人認為，由于它們是一種平面型三環(huán)分子，結(jié)構(gòu)與一個嘌呤–嘧啶對十分相似，故能嵌入兩個相鄰DNA堿基對之間，造成雙螺旋的部分解開（兩個堿基對原來相距0.34nm，當嵌入一個丫啶分子時，就變成0.68nm），從而在DNA復(fù)制過程中，會使鏈上增添或缺失一個堿基，結(jié)果就引起了移碼突變。當前第50頁\共有117頁\編于星期五\22點丫啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復(fù)突變圖示正常DNA鏈上的三聯(lián)密碼子：∣ABC∣ABC∣ABC∣ABC∣ABC∣ABC∣ABC∣ABC∣第三個密碼子中增添一個堿基后的三聯(lián)密碼子： ↓增添了一個堿基∣ABC∣ABC∣AB+∣CAB∣CAB∣CAB∣CAB∣CAB在第二個密碼子中缺失一個堿基A后引起的變化↓缺失了一個堿基A∣ABC∣BCA∣BCA∣BCA∣BCA∣BCA∣BCA∣BCA增添一個堿基和缺失一個堿基后，其密碼子又恢復(fù)正常： ↓增添了一個堿基↓缺失一個B∣ABC∣ABC∣AB+∣CAB∣CAB∣CAC∣ABC∣ABC增添三個堿基后，只引起一段密碼子不正常： 加進了三個堿基∣ABC∣AB+∣CAB∣+CA∣B+C∣ABC∣ABC如缺失三個堿基，也只引起一段密碼子不正常：↓ ↓ ↓∣ABC∣ACA∣BCA∣BAB∣CAC∣ABC∣ABC∣ABC由此可見，在DNA鏈上增添或缺失一、二或四、五個堿基時，均可引起移碼突變，而增添或缺失三個或六個時，則不影響讀碼，只引起短的缺失或增添（插入）。當前第51頁\共有117頁\編于星期五\22點染色體畸變（chromosomalaberration）某些理化因子，如X射線等的輻射及烷化劑、亞硝酸等，除了能引起點突變外，還會引起DNA的大損傷（macrolesion）——染色體畸變，包括以下兩個方面：

染色體結(jié)構(gòu)上的缺失（deletion）、重復(fù)（duplication）、易位（translocation）和倒位（inversion）染色體數(shù)目的變化。當前第52頁\共有117頁\編于星期五\22點染色體結(jié)構(gòu)上的變化染色體內(nèi)畸變只涉及一條染色體上的變化，如發(fā)生染色體的部分缺失或重復(fù)時，其結(jié)果可造成基因的減少或增加；又如發(fā)生倒位或易位時，則可造成基因排列順序的改變，但數(shù)目卻不改變。倒位是指斷裂下來的DNA片段旋轉(zhuǎn)180°后，重新插入到原來染色體的位置上；易位則指斷裂下來的一小段染色體再順向或逆向地插入到同一條染色體的其它部位上。染色體間畸變，則指非同源染色體間的易位。當前第53頁\共有117頁\編于星期五\22點紫外線（U.V.，ultravioletray）對DNA的損傷嘧啶對紫外線的敏感性要比嘌呤強得多。嘧啶的光化產(chǎn)物主要是二聚體和水合物，其中了解較清楚的是胸腺嘧啶二聚體的形成和消除。

紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰胸腺嘧啶間形成共價結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體，它的出現(xiàn)會減弱雙鏈間氫鍵的作用，并引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對，從而引起突變或死亡。在互補雙鏈間形成嘧啶二聚體的機會較少，但一旦形成，就會妨礙雙鏈的解開，因而影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并使細胞死亡。當前第54頁\共有117頁\編于星期五\22點

誘變因素在DNA上的初級效應(yīng) 遺傳效應(yīng)

堿基類似物 摻入作用 AT=GC雙向轉(zhuǎn)換

羥胺 與胞嘧啶起反應(yīng)GC→AT的轉(zhuǎn)換

亞硝酸 A、G、C的氧化脫氨作用AT=GC雙向轉(zhuǎn)換交聯(lián) 缺失

烷化劑 烷化堿基（主要是G）AT=GC雙向轉(zhuǎn)換烷化磷酸基團AT→TA的顛換喪失烷化的嘌呤GC→CG的顛換

糖-磷酸骨架的斷裂 巨大損傷

丫啶類 堿基之間的相互作用碼組移動

紫外線 形成嘧啶的水合物GC→AT轉(zhuǎn)換

形成嘧啶的二聚體碼組移動

電離輻射 堿基的羥基化降解AT=GC雙向轉(zhuǎn)換

DNA降解碼組移動（＋或－）

糖-磷酸骨架的斷裂巨大損傷

喪失嘌呤 CG→TA轉(zhuǎn)換

Mu噬菌體 結(jié)合到一個基因中間 碼組移動

當前第55頁\共有117頁\編于星期五\22點自發(fā)突變機制自發(fā)突變是指在沒有人工參與的情況下生物體自然發(fā)生的突變幾種自發(fā)突變的可能機制背景輻射和環(huán)境因素的影響：由于一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素的長期總和誘變效應(yīng)。如各種短波輻射或高溫誘變效應(yīng)，以及自然界中普遍存在的一些低濃度的誘變物質(zhì)（在微環(huán)境中有時也可能是高濃度）的作用等。微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng)：過氧化氫對Neurospora有誘變作用，在許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株，可能也是同樣的原因。氨基的互變異構(gòu)效應(yīng)：T和G會以酮式或烯醇式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn)，而C和A則會以氨基式或亞氨基式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn)。環(huán)出效應(yīng)：在DNA的復(fù)制過程中，某一單鏈上偶然產(chǎn)生一個小環(huán)，則會因其上的基因越過復(fù)制而發(fā)生遺傳缺失。當前第56頁\共有117頁\編于星期五\22點基因突變的修復(fù)光復(fù)活作用切除修復(fù)重組修復(fù)SOS修復(fù)當前第57頁\共有117頁\編于星期五\22點光復(fù)活作用（photoreactivation）把經(jīng)紫外線照射后的微生物立即暴露于可見光下時，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復(fù)活作用。光復(fù)活機理：經(jīng)紫外線照射所形成的帶有胸腺嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗中與光激活酶（photoreactivatingenzyme）（又稱光裂合酶photolyase）結(jié)合，形成的復(fù)合物暴露在可見光（300~500nm）下時，此酶會因獲得光能而發(fā)生解離，從而使二聚體重新分解成單體。由于在一般的微生物中都存在著光復(fù)活作用，所以在進行紫外線誘變育種時，只能在紅光下進行照射及處理照射后的菌液。當前第58頁\共有117頁\編于星期五\22點暗修復(fù)作用（darkrepair）暗修復(fù)作用又稱切除修復(fù)（excisionrepair），是細胞內(nèi)的主要修復(fù)系統(tǒng)，用于修復(fù)被誘變劑（包括紫外線、烷化劑、X射線和γ射線等）損傷后的DNA的機制。全部修復(fù)過程由四種酶完成，即①內(nèi)切核酸酶在胸腺嘧啶二聚體的5’一側(cè)切開一個3’-OH和5’-P的單鏈缺口；②外切核酸酶從5’-P至3’-OH方向切除二聚體，并擴大缺口；③DNA聚合酶修補缺口④連接酶連接裂口當前第59頁\共有117頁\編于星期五\22點重組修復(fù)一種越過損傷的修復(fù)機制，即通過交換，在嘧啶二聚體相應(yīng)部位的子鏈上出現(xiàn)了缺口，該缺口由DNA聚合酶和連接酶修復(fù)。親本鏈的嘧啶二聚體需切除修復(fù)當前第60頁\共有117頁\編于星期五\22點SOS修復(fù)修復(fù)基因：lexA、recA、uvrA、uvrB、uvrC修復(fù)機理：lexA為調(diào)節(jié)基因，產(chǎn)生的阻遏蛋白在正常條件下與recA、uvrA、uvrB、uvrC的操作子結(jié)合，使細胞內(nèi)僅合成少量的uvr蛋白（修復(fù)蛋白），對自發(fā)突變產(chǎn)生的低水平的損傷進行修復(fù)。當細胞內(nèi)產(chǎn)生大量嘧啶二聚體時，在復(fù)制過程中因不能得到修復(fù)而在子鏈上留下空隙和單鏈，少量的RecA蛋白立即與單鏈結(jié)合并激活其活性，RecA蛋白降解LexA阻遏蛋白，解除了對RecA蛋白和其他修復(fù)蛋白基因的抑制，對大量的二聚體進行切除修復(fù)。當前第61頁\共有117頁\編于星期五\22點第五節(jié)基因重組基因重組（generecombination）：凡把兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個體的方式。重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下，也能產(chǎn)生新遺傳型的個體。重組是分子水平上的一個概念，而一般所說的雜交（hybridization）則是細胞水平上的一個概念。雜交中必然包含著重組，而重組則不限于雜交這一形式。真核微生物中的有性雜交、準性雜交（parasexualhybridization）等原核生物中的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和原生質(zhì)體融合等都是基因重組在細胞水平上的反映。當前第62頁\共有117頁\編于星期五\22點基因重組的意義基因重組是雜交育種的理論基礎(chǔ)。雜交育種的優(yōu)點：①由于雜交育種選用了已知性狀的供體菌和受體菌作為親本，故在方向性和自覺性方面，均比誘變育種前進了一大步。②利用雜交育種可以消除某一菌株在經(jīng)過長期誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象雜交育種的缺點：雜交育種的方法較復(fù)雜，目前還沒有得到普遍的推廣和使用，尤其在原核生物的領(lǐng)域中，應(yīng)用轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合等重組技術(shù)來培育可應(yīng)用于生產(chǎn)實踐上的高產(chǎn)菌株的例子還不多見。到了70年代后期，由于原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得巨大的成功后，才使重組育種技術(shù)獲得了飛速的發(fā)展。當前第63頁\共有117頁\編于星期五\22點一、原核微生物的基因重組轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)接合原生質(zhì)體融合基因重組的方式當前第64頁\共有117頁\編于星期五\22點轉(zhuǎn)化（transformation）轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化作用：受體菌（recipient或receptor）直接吸收了來自供體菌（donor）的DNA片段，通過交換整合到自己的基因組中，從而獲得部分新的遺傳型狀的現(xiàn)象。接受了供體菌DNA的受體菌稱為轉(zhuǎn)化子（transformant）。范圍：原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個較普遍的現(xiàn)象。若干放線菌和藍細菌及少數(shù)真核微生物也有轉(zhuǎn)化報道。轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件兩個菌種或菌株之間能否發(fā)生轉(zhuǎn)化，與它們在進化過程中的親緣關(guān)系有著密切的關(guān)系。但即使在轉(zhuǎn)化率極高的那些種中，其不同菌株間也不一定都可發(fā)生轉(zhuǎn)化。進行轉(zhuǎn)化的受體細胞必須處于感受態(tài)（competence），亦即受體細胞最易接受外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。也可以采用人工的方法使細菌轉(zhuǎn)變成感受態(tài)當前第65頁\共有117頁\編于星期五\22點感受態(tài)因子：一種細胞外蛋白，可與受體菌細胞表面的特異受體結(jié)合，結(jié)果激活細胞內(nèi)一系列與轉(zhuǎn)化有關(guān)的基因的表達，其中產(chǎn)生的自溶素使細胞表面的DNA結(jié)合蛋白和核酸酶裸露出來，以完成轉(zhuǎn)化過程。不同細菌，每個細胞上的DNA結(jié)合位點數(shù)不同。轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)一般是DNA，經(jīng)多次提純操作后，每一轉(zhuǎn)化DNA片段的分子量都小于1×107，約占細菌核染色體組的0.3%。據(jù)研究，呈質(zhì)粒形式的轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)化頻率最高；一般的轉(zhuǎn)化因子都是線狀雙鏈DNA；也有線狀單鏈DNA具有轉(zhuǎn)化作用的報道。轉(zhuǎn)化過程：以S.Pneumonia為例分為六階段：當前第66頁\共有117頁\編于星期五\22點雙鏈DNA片段與感受態(tài)受體菌細胞表面的DNA結(jié)合位點（主要在新形成細胞壁的赤道區(qū)）結(jié)合；在吸附位點上的DNA被核酸內(nèi)切酶分解，形成平均分子量為4~5×106的DNA片段；DNA雙鏈中的一條單鏈被膜上的另一種核酸酶切除，另一條單鏈逐步進入細胞，這是一個耗能的過程。分子量小于5×105的DNA片段不能進入細胞。來自供體菌的單鏈DNA片段在細胞內(nèi)與受體細胞核染色體組上的同源區(qū)配對交換，形成了一個雜合DNA區(qū)段（heterozygousregion）。在這一過程中，有核酸酶、DNA聚合酶和DNA連接酶的參與；受體菌的染色體組進行復(fù)制，雜合區(qū)段分離成兩個，其中之一獲得了供體菌的轉(zhuǎn)化基因，另一個未獲供體基因；當細胞發(fā)生分裂后，一個子細胞含供體基因，這就是轉(zhuǎn)化子；另一個細胞與原始受體菌一樣。當前第67頁\共有117頁\編于星期五\22點轉(zhuǎn)染（transfection）：把噬菌體或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出來，讓它去感染感受態(tài)的宿主細胞，并進而產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒的后代，這種現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)染（transfection）。它與轉(zhuǎn)化不同之處是病毒或噬菌體并非遺傳基因的供體菌，中間也不發(fā)生任何遺傳因子的交換或整合，最后也不產(chǎn)生具有雜種性質(zhì)的轉(zhuǎn)化子。當前第68頁\共有117頁\編于星期五\22點轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過完全缺陷或部分缺陷噬菌體的媒介，把供體細胞的DNA小片段攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳形狀的現(xiàn)象。獲得新遺傳形狀的受體細胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式：

普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)

當前第69頁\共有117頁\編于星期五\22點普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）通過完全完全缺陷噬菌體對供體菌任何小片段的誤包，而實現(xiàn)其遺傳性狀傳遞到受體菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象當前第70頁\共有117頁\編于星期五\22點普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（completetransduction）P22

噬菌體引起的

S.typhimurum的普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)過程

當前第71頁\共有117頁\編于星期五\22點局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（specializdtransduction）概念：通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并獲得表達的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。特點：僅轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌的個別基因（一般為噬菌體整合位點兩側(cè)的基因）；特定的基因由部分缺陷噬菌體攜帶；缺陷噬菌體是由于其在形成過程中所發(fā)生的低頻率誤切（誤切的頻率一般在10-5左右，如E.coli

噬菌體引起的半乳糖利用、產(chǎn)生物素基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)）而形成。當前第72頁\共有117頁\編于星期五\22點接合（conjugation）概念：供體菌通過性菌毛傳遞不同長度的單鏈DNA給受體菌，在后者細胞中發(fā)生交換、整合，從而使后者獲得供體菌的遺傳性狀的現(xiàn)象。獲得新性狀的受體細胞稱為接合子。存在范圍：細菌和放線菌中都存在接合現(xiàn)象。E.coli的四種相互聯(lián)系的接合型菌株：F+菌株、F-菌株F’菌株Hfr菌株的概念F+×F-F’×F-Hfr×F-的接合結(jié)果當前第73頁\共有117頁\編于星期五\22點F+×F-F’×F-Hfr×F-的接合結(jié)果F+×F-2

F+

F’×F-2F’

Hfr×F-Hfr+受體菌獲得Hfr菌株部分遺傳性狀當前第74頁\共有117頁\編于星期五\22點原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）概念：通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時帶有雙親性狀的、遺傳性穩(wěn)定的融合子的過程，稱為原生質(zhì)體融合。原生質(zhì)體融合的優(yōu)點：可以提高重組率雙親可以少帶標記或不帶標記可進行多親本融合有利于不同種間、屬間微生物的雜交通過原生質(zhì)體融合提高產(chǎn)量當前第75頁\共有117頁\編于星期五\22點原生質(zhì)體融合操作示意圖

去壁

[A+B-]

（高滲下）[A+B-]

PEG或電脈沖離心促融去壁

[A-B+]

（高滲下）[A-B+]

融合子（AA,BB,AB）長成菌落[--]檢出[A+B+]融合子篩選優(yōu)良性狀的融合子當前第76頁\共有117頁\編于星期五\22點二、真核微生物的基因重組真核微生物的基因重組的方式有性雜交：一般指性細胞之間的結(jié)合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術(shù)。準性雜交：同種生物的兩個不同的體細胞發(fā)生融合，以有絲分裂的方式而導(dǎo)致低頻率的基因重組并產(chǎn)生重組子的雜交方式。當前第77頁\共有117頁\編于星期五\22點Saccharomycescerevisiae的雜交育種過程：將甲親本與乙親本菌株（雙倍體）分別接種到含醋酸鈉等產(chǎn)孢子培養(yǎng)基斜面上，用蒸餾水洗下子囊，機械法破壞子囊獲得子囊孢子，將子囊孢子鋪平板獲得單倍體細胞組成的菌落，通過離心等方法使單倍體細胞密集接觸，即有機會產(chǎn)生雙倍體的有性雜交后代。S.Cerevisiae的雙倍體和單倍體細胞的比較項目雙倍體單倍體細胞菌落液體培養(yǎng)產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上大，橢圓形大，形態(tài)均一繁殖較快，細胞較分散形成子囊小，球形小，形態(tài)變化較多繁殖較慢，細胞常聚集成團不形成子囊當前第78頁\共有117頁\編于星期五\22點準性生殖（parasexualhybridization）存在范圍：常見于某些真菌，尤其是半知菌基本過程：

菌絲連接形成異核體核融合體細胞交換Penicilliumurticae的準性生殖育種過程

選擇親本：（用營養(yǎng)缺陷型作為遺傳標記）強制異合：（用基本培養(yǎng)基篩選形成異核體的細胞和雜合二倍體細胞）移單菌落：（將在基本培養(yǎng)基上生長的單菌落移種到基本培養(yǎng)基斜面上）選擇重組體：（采用各種選擇培養(yǎng)基選擇不同的融合子）

當前第79頁\共有117頁\編于星期五\22點第六節(jié)微生物育種

自發(fā)突變與育種誘變育種當前第80頁\共有117頁\編于星期五\22點從生產(chǎn)中選育：在生產(chǎn)過程中，微生物以一定頻率發(fā)生自發(fā)突變。為選育優(yōu)良的生產(chǎn)菌種創(chuàng)造了機會。定向培育優(yōu)良品種：一般指用某一特定因素長期處理某微生物的群體（culturepopulation），同時不斷地對它們進行移種傳代，以達到積累并選擇相應(yīng)的自發(fā)突變株的目的。采用梯度平板法（gradientplate）篩選抗代謝拮抗物的突變株，以提高相應(yīng)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量方面的工作，可認為是微生物定向培育技術(shù)的一大進展。例如，異煙肼是吡哆醇的代謝拮抗物（即結(jié)構(gòu)類似物），篩選抗異煙肼的菌株，可得到吡哆醇的高產(chǎn)菌。當前第81頁\共有117頁\編于星期五\22點定向培育抗異煙肼的吡哆醇高產(chǎn)突變株的方法先在培養(yǎng)皿中加入10ml的一般瓊脂培養(yǎng)基，使皿底斜放，待凝固后，將皿底放平，再在原先的培養(yǎng)基上倒10ml含有適當濃度（通過實驗來決定）的異煙肼培養(yǎng)基，待凝。在制成的瓊脂平板上存在一個由濃到稀的異煙肼的濃度梯度。然后涂以大量的酵母細胞，經(jīng)培養(yǎng)后，在低濃度的異煙肼區(qū)域，長滿了原始的敏感菌，在高濃度區(qū)域，酵母細胞生長受到了抑制，在濃度適中的部位出現(xiàn)少數(shù)由抗異煙肼的細胞所形成的菌落。這類抗性菌落可能因產(chǎn)生了可分解異煙肼的酶類，更多的是通過合成更高濃度的代謝產(chǎn)物——吡哆醇來克服異煙肼的競爭性抑制作用。在酵母菌中，通過梯度平板法曾獲得吡哆醇產(chǎn)量比原菌株提高7倍的突變株。應(yīng)用同樣原理，還可獲得其它種種有關(guān)代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株。當前第82頁\共有117頁\編于星期五\22點用梯度平板法定向培育若干代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株代謝產(chǎn)物 產(chǎn)生菌 抗代謝物

肌苷Bacilluspumibus8-氮雜嘌呤肌苷Corynebacteriumsp.6-巰鳥嘌呤腺嘌呤Salmonellatyphimutium2,6-二氨基嘌呤煙堿酸Chlamydomonaseugametos3-乙酰吡啶色氨酸Salmonellatyphi6-甲基色氨酸甲硫氨酸Escherichiacoli乙硫氨酸酪氨酸E.Coli對氟苯丙氨酸亮氨酸S.Typhi三氟-DL-亮氨酸

吡咯疊氮Pseudomonasaureofaciens6-氟色氨酸當前第83頁\共有117頁\編于星期五\22點誘變育種誘變育種：利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻而分散的微生物細胞群，促進其突變率顯著提高，然后采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合育種目的的突變株，以供生產(chǎn)實踐或科學(xué)研究之用。

誘變育種具有極其重要的實踐意義。當前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。當前第84頁\共有117頁\編于星期五\22點誘變育種的基本環(huán)節(jié)以選育高產(chǎn)突變株為例，誘變育種的基本環(huán)節(jié)概括如下：

絕大多數(shù)

個體死亡出發(fā)菌株誘變 多數(shù)未變

少數(shù)存活

少數(shù)突變 多數(shù)幅度小

少數(shù)正變 多數(shù)不宜投產(chǎn)

少數(shù)幅度大

少數(shù)適宜投產(chǎn)

可計算：存活率 突變率正變率“高產(chǎn)率” “投產(chǎn)率”

當前第85頁\共有117頁\編于星期五\22點誘變育種工作中應(yīng)考慮的幾個原則 選擇簡便有效的誘變劑：

物理誘變劑：紫外線、激光；X射線、γ射線和快中子等。

化學(xué)誘變劑：主要有烷化劑、堿基類似物和丫啶類化合物。

擬輻射物質(zhì)：有些烷化劑例如氮芥、硫芥和環(huán)氧乙烷等除了能誘發(fā)各種點突變外，還能誘發(fā)一般只有輻射才能誘發(fā)的染色體畸變，所以它們也被稱為擬輻射物質(zhì)。

由于一切生物的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)都是核酸尤其是DNA，所以任何能改變核酸結(jié)構(gòu)的因素都可引起核酸生物學(xué)功能的改變。同樣，凡能引起核酸的其他功能改變的因素，一般也能引起突變。當前第86頁\共有117頁\編于星期五\22點艾姆斯試驗測定潛在化學(xué)致癌物的基本原理艾姆斯試驗測定潛在化學(xué)致癌物的基本原理Salmonellatyphimurium的組氨酸缺陷型（his―）菌株在[―]平板上不能生長，如發(fā)生回復(fù)突變則能生長。如將可疑“三致”物黃曲霉毒素，加入鼠肝勻漿，保溫一段時間后，吸入濾紙片中，然后將濾紙片放置于[―]平板中央。經(jīng)培養(yǎng)后，出現(xiàn)三種情況：如在平板上無大量菌落產(chǎn)生，說明試樣中不含誘變劑；如在紙片周圍有一抑制圈，其外才是大量菌落，說明試樣中某誘變劑的濃度很高；如在紙片周圍即生長大量菌落，說明誘變劑的濃度合適。目前，艾姆斯試驗法已廣泛用于檢測食品、飲料、藥物核引水等試樣中的致癌物。它具有快速（僅3天左右）、準確（檢測致癌物的符合率＞85%）和費用省等優(yōu)點。當前第87頁\共有117頁\編于星期五\22點選擇誘變劑的種類：在選用理化因子作誘變劑時，在同樣效果下，應(yīng)選用最方便的因素；而在同樣方便的情況下，則應(yīng)選擇最高效的因素。在物理誘變劑中，尤以紫外線為最方便，而在化學(xué)誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)。采用簡便有效的誘變方法：紫外線的照射最為方便?；瘜W(xué)誘變劑的種類、濃度和處理方法尤其是中止反應(yīng)的方法很多，實際工作時可參看有關(guān)書籍。一種較有效的簡易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上出發(fā)菌株細胞，然后在平板上均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒（也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片），經(jīng)培養(yǎng)后，在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落，分別制成懸浮液，然后將其涂在一般平板表面使長出許多單菌落，最后可用影印培養(yǎng)法或逐個檢出法選出突變種。當前第88頁\共有117頁\編于星期五\22點充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)（synergism）誘變劑的復(fù)合處理常常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)，這對育種工作是很有參考價值的。復(fù)合處理有幾類：①兩種或多種誘變劑的先后使用；②同一種誘變劑的重復(fù)使用；③兩種或多種誘變劑的同時使用。當前第89頁\共有117頁\編于星期五\22點挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株（originalstrain）選用出發(fā)菌株的一般原則：①最好是經(jīng)過生產(chǎn)中選育過的自發(fā)變異菌株；②采用具有優(yōu)良性狀的菌株，如生長速度快、營養(yǎng)要求低以及產(chǎn)孢子早而多的菌株③選擇已發(fā)生其他變異的菌株作為出發(fā)菌株；④細菌中發(fā)現(xiàn)稱為增變菌株的變異菌株，更適宜作出發(fā)菌株；⑤在選擇產(chǎn)核苷酸或氨基酸的出發(fā)菌株時，最好考慮至少能累積少量所需產(chǎn)物或其前體的菌株，而在選擇產(chǎn)抗生素的出發(fā)菌株時，最好選擇已通過幾次誘變并發(fā)現(xiàn)每次的效價都有一定程度提高的菌株作為出發(fā)菌株。當前第90頁\共有117頁\編于星期五\22點處理單孢子（或單細胞）懸液對單細胞微生物必須處理單細胞、均勻懸液的原因分散狀態(tài)的細胞可以均勻接觸誘變劑，避免長出不純菌落。處理霉菌或放線菌孢子的原因：絲狀微生物的細胞內(nèi)同時含有幾個核，故某一突變無法反映在當代的表型上。只有當經(jīng)過DNA的復(fù)制發(fā)生細胞分裂后，這一變異才會在表型上表達出來，于是出現(xiàn)了不純菌落，這就叫表型延遲（phenotypiclag）（或由于誘變劑一般只作用于DNA雙鏈中的某一條單鏈，也會出現(xiàn)表型延遲）。這也是誘變育種工作中初分離的菌株經(jīng)傳代后很快出現(xiàn)生產(chǎn)性狀“衰退”的主要原因。細胞的生理狀態(tài)對誘變的效果會發(fā)生很大的影響。獲得均勻分散的細胞懸液的方法：用無菌的玻璃珠打碎成團的細胞，然后再用脫脂棉過濾。誘變后出現(xiàn)的不純菌落，則可用適當?shù)姆蛛x純化方法加以純化。當前第91頁\共有117頁\編于星期五\22點利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標 為了確切某一突變株產(chǎn)量性狀的提高程度，必須進行大量的分析測定和統(tǒng)計工作，而一些形態(tài)變異雖能直接和迅速地加以觀察，但又不一定與產(chǎn)量變異相關(guān)。如果能找到這兩者間的相關(guān)性，則育種時初篩的效率就可大大提高。如在灰黃霉素產(chǎn)生菌蕁麻青霉的育種中，發(fā)現(xiàn)菌落的棕紅顏色變深者，產(chǎn)量往往有所提高；

形態(tài)、生理與代謝產(chǎn)物產(chǎn)量間的相關(guān)性常?？赏ㄟ^人們的努力而加以創(chuàng)造。利用鑒別性培養(yǎng)基的原理或其它方法就可有效地把原來肉眼所觀察不到的生理性狀或產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化為可見的“形態(tài)”性狀。例如，在瓊脂平板上，通過蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶變色圈的大小，抗生素抑制圈的大小，生長因子周圍某菌生長圈的大小，以及外毒素的沉淀反應(yīng)圈的大小等，都可用于初篩工作中估計某菌產(chǎn)生相應(yīng)代謝產(chǎn)物能力的“形態(tài)”指標。當前第92頁\共有117頁\編于星期五\22點選用最適劑量誘變劑劑量一般指強度與作用時間的乘積。各種誘變劑有不同的劑量表示方式，如化學(xué)誘變劑以一定溫度下誘變劑的濃度和處理時間來表示。在育種實踐中，常以殺菌率來作誘變劑的相對劑量。誘變劑的合適劑量：凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上，能擴大變異幅度，促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量。要確定一個合適的劑量，常常要經(jīng)過多次試驗。就一般微生物而言，在一定的劑量范圍內(nèi)，突變率往往隨劑量的增高而提高，但正變較多出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負變則較多出現(xiàn)在偏高的劑量中；還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，更容易出現(xiàn)負變。因此，在誘變育種工作中，目前大家比較傾向于采用較低的劑量。當前第93頁\共有117頁\編于星期五\22點篩選方案在實際工作中，一般認為應(yīng)采用把篩選工程分為初篩與復(fù)篩兩個階段的篩選方案為好。前者以量（選留菌株的數(shù)量）為主，后者以質(zhì)（測定數(shù)據(jù)的精確度）為主。例如，在工作量限度為200只搖瓶的具體條件下，為了取得更大的工效，有人提出了一些優(yōu)選的篩選方案（可參考有關(guān)專著）當前第94頁\共有117頁\編于星期五\22點篩選方法一般通過初篩與復(fù)篩對突變株進行生產(chǎn)性能的測定。初篩既可在培養(yǎng)皿平板上進行，也可在搖瓶中進行，兩者各有利弊。復(fù)篩是對突變株的生產(chǎn)性能作比較精確的定量測定。一般是將微生物搖瓶培養(yǎng)，然后再對培養(yǎng)液進行分析測定。不僅需要設(shè)計效率更高的篩選方法，還應(yīng)努力推廣篩選操作的自動化。

當前第95頁\共有117頁\編于星期五\22點.營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選

當前第96頁\共有117頁\編于星期五\22點與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的三類培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基（MM，minimalmedium）：僅能滿足某微生物的野生型菌株生長需要的最低成分組合培養(yǎng)基，稱基本培養(yǎng)基?？捎梅枴癧－]”來表示。完全培養(yǎng)基（CM，completemedium）：凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的組合培養(yǎng)基，可稱為完全培養(yǎng)基?？捎梅枴癧＋]”。補充培養(yǎng)基（SM，supplementalmedium）：凡只能滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型生長需要的組合培養(yǎng)基，稱為補充培養(yǎng)基。補充培養(yǎng)基的符號可根據(jù)加入的是A或B等代謝物而分別用[A]或[B]等來表示。

當前第97頁\共有117頁\編于星期五\22點與營養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個體野生型：從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株。營養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)誘變處理后，喪失了某酶的合成能力，只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中生長，這類突變稱為營養(yǎng)缺陷型突變株（簡稱營養(yǎng)缺陷型）。原養(yǎng)型：營養(yǎng)缺陷型突變經(jīng)回變或重組后產(chǎn)生的菌株，營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。當前第98頁\共有117頁\編于星期五\22點營養(yǎng)缺陷型的篩選方法誘變劑處理淘汰野生型（抗生素法、菌絲過濾法）檢出缺陷型（夾層培養(yǎng)法、限量補充培養(yǎng)法、逐個檢出法、影印接種法）鑒定缺陷型（生長譜法）當前第99頁\共有117頁\編于星期五\22點第七節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯和保藏衰退與復(fù)壯的概念衰退（degeneration）：在微生物的生長過程中，由于變異的存在，使原有的優(yōu)良性狀發(fā)生負變，即菌種的衰退。

復(fù)壯(rejuvenation)：狹義的復(fù)壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和生產(chǎn)性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個體，以達到恢復(fù)該菌原有典型性狀的措施；廣義的復(fù)壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識的經(jīng)常、進行純種的分離和生產(chǎn)性能測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種當前第100頁\共有117頁\編于星期五\22點防止菌種衰退的方法控制傳代的次數(shù)（一般在DNA的復(fù)制過程中，堿基的錯配率是5x10-4，自發(fā)突變的頻率為10-8~10-9，采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的次數(shù)）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件利用不同類型的細胞進行接種傳代：對絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進行接種。采用有效的菌種保藏方法