第四章細(xì)胞培養(yǎng)與代謝調(diào)控

第四章細(xì)胞培養(yǎng)與代謝調(diào)控第一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一一、細(xì)胞培養(yǎng)概述細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織分離細(xì)胞，模擬體內(nèi)環(huán)境，在無菌、適當(dāng)條件下使其生長繁殖一種技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)的對象是單個細(xì)胞或細(xì)胞群。細(xì)胞培養(yǎng)影響的環(huán)境因素：營養(yǎng)、pH、滲透壓、溶解氧、光照、剪切力等。第二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一1、細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展簡史及有關(guān)概念

1907年，美國生物學(xué)家哈里森將蛙胚的神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，保持存活了幾周，并觀察了神經(jīng)突起的生長現(xiàn)象。被稱為“細(xì)胞（組織）培養(yǎng)之父”。

Carrel1912年提出無菌操作技術(shù)，1923年又設(shè)計了卡氏培養(yǎng)瓶。

現(xiàn)在，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中的一項重要的手段。近年來，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、藥理學(xué)、免疫學(xué)、老年學(xué)、腫瘤學(xué)和病毒學(xué)以及臨床各學(xué)科領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用，并取得了豐碩成果。第三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一1）細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）

是指將組織取出后，用化學(xué)或物理的方法，將其分散成單個細(xì)胞在體外條件下進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞在培養(yǎng)的過程中不再形成組織。培養(yǎng)物是單個細(xì)胞或細(xì)胞群。

從廣義上講，體外(invitro)培養(yǎng)包括所有結(jié)構(gòu)層次的培養(yǎng)，即器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)。2)組織培養(yǎng)（tissueculture）

指從體內(nèi)取出組織，在體外模擬體內(nèi)生理條件，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。此時可能有組織分化并保持組織的結(jié)構(gòu)與功能。培養(yǎng)物是組織碎塊或器官的一部分。第四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一3）器官培養(yǎng)（organculture）

指器官的胚芽、整個器官在體外條件下的保存或生長，此時亦能有器官的分化并保持器官的立體結(jié)構(gòu)和功能。

實際上，在體外培養(yǎng)時，無論采用什么方法和條件，培養(yǎng)的主要成份仍然是細(xì)胞。另外，細(xì)胞培養(yǎng)也并不意味著細(xì)胞彼此是獨立的，細(xì)胞在培養(yǎng)中的生命活動和體內(nèi)細(xì)胞一樣，仍然是相互依存，呈現(xiàn)一定的“組織”特性。所以組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)并無嚴(yán)格區(qū)別，常用作同義語使用。第五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一4）原代培養(yǎng)(primaryculture)

將機(jī)體取出的細(xì)胞或組織進(jìn)行實效（立即）培養(yǎng)的過程，又稱初培養(yǎng)。初培養(yǎng)的細(xì)胞大約增殖10代左右，這樣的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞。5）傳代培養(yǎng)(passageculture)

指從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，又稱繼代培養(yǎng)。第六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一6）細(xì)胞系（cellline）

由原代培養(yǎng)產(chǎn)生的能進(jìn)行無限次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞群即成細(xì)胞系。此時細(xì)胞發(fā)生了遺傳突變，染色體呈亞二倍體或非整倍體，失去接觸抑制特性。

目前常用的細(xì)胞系有：3T3（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）；CHO（正常中國倉鼠卵巢細(xì)胞）；L（小鼠腫瘤細(xì)胞）；BHK（敘利亞倉鼠腎）；Hela（人宮頸癌細(xì)胞)7）細(xì)胞株（cellstrain）

原代培養(yǎng)細(xì)胞能順利傳代，且保持原來染色體的二倍體數(shù)量和接觸抑制行為，把這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞株。8）克?。╟lone）

又稱無性繁殖系或無性系，指由一個細(xì)胞或共同祖先通過有絲分裂所產(chǎn)生的遺傳特性一致的細(xì)胞群或生物群，亦指DNA片段群第七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一二、細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)時營養(yǎng)成分添加以及培養(yǎng)液與細(xì)胞收集方式的不同，細(xì)胞培養(yǎng)有：分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式和灌流式5種操作方式。第八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一1、分批式培養(yǎng)分批培養(yǎng)是指細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入到培養(yǎng)容器或生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液體積不變，不添加營養(yǎng)成分，待細(xì)胞增長和產(chǎn)物積累到適當(dāng)時間，一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物和培養(yǎng)液的方法。特點：（1）操作簡單，培養(yǎng)周期短。（2）直觀反映細(xì)胞生長代謝過程。（3）可直接放大。缺點：不能控制底物濃度、細(xì)胞容易老化、生長周期短、效率低等第九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一2、流加式培養(yǎng)分批培養(yǎng)是指在分批培養(yǎng)過程中，間歇或連續(xù)地不加一種或多種營養(yǎng)成分的培養(yǎng)方法。與分批培養(yǎng)相比，其具有以下優(yōu)點：（1）可根據(jù)細(xì)胞生長速率、營養(yǎng)消耗情況，保證合理、充足的營養(yǎng)。（2）可以減少產(chǎn)物反饋抑制，排除有害代謝產(chǎn)物積累帶來的細(xì)胞損傷。細(xì)胞不易老化。（3）可以避免在分批培養(yǎng)終因一次投料過多造成的底物抑制等影響，改善培養(yǎng)液流體學(xué)性質(zhì)。（4）可以延長指數(shù)生長期，從而提高細(xì)胞密度，延長細(xì)胞培養(yǎng)周期。產(chǎn)物濃度較高，又能實現(xiàn)連續(xù)收獲。單一補(bǔ)料，反復(fù)補(bǔ)料。第十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一3、半連續(xù)式培養(yǎng)半連續(xù)式培養(yǎng)又稱重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每隔一段時間從中取出部分培養(yǎng)液或者細(xì)胞，剩余的細(xì)胞作為種子，再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原體積，是反應(yīng)期內(nèi)的總體積不變。每次稀釋培養(yǎng)體積的1/2~3/4。特點：（1）細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)很長時間。（2）可進(jìn)行多次收獲。（3）操作簡便，生產(chǎn)效率高。

第十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一4、連續(xù)式培養(yǎng)連續(xù)式培養(yǎng)是在細(xì)胞達(dá)最大濃度以前，以一定速度向反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)液，同時含有細(xì)胞的培養(yǎng)液以相同速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積恒定的培養(yǎng)方式。特點：（1）細(xì)胞能在恒定狀態(tài)下生長，營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH基本卡保持恒定細(xì)胞濃度以及生長速率可基本維持不變，細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)生長。（2）穩(wěn)定狀態(tài)可有效地延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)生長期。

第十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一5、灌流式培養(yǎng)灌流式培養(yǎng)是指把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入生物反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地取出部分培養(yǎng)液，同時又連續(xù)不斷地補(bǔ)充新的培養(yǎng)液。與連續(xù)式操作的不知處在于取出培養(yǎng)液時，細(xì)胞均保留在生物反應(yīng)器內(nèi)。特點：（1）細(xì)胞截留系統(tǒng)可使細(xì)胞保留在生物反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞濃度。（2）能使細(xì)胞處在較穩(wěn)定的營養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低。（3）反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期長，可提高生產(chǎn)效率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高。（4）產(chǎn)品在反應(yīng)器內(nèi)停留時間短，可及時回收，有利于保護(hù)產(chǎn)品的活性。第十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一三、細(xì)胞培養(yǎng)動力學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)動力學(xué)（dynamicsofcellcultivation）：是研究細(xì)胞生長、基質(zhì)消耗以及產(chǎn)物生成規(guī)律的科學(xué)，包括細(xì)胞生長動力學(xué)、基質(zhì)消耗動力學(xué)以及產(chǎn)物生成動力學(xué)。第十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一分批培養(yǎng)生長動力學(xué)在分批培養(yǎng)過程中，細(xì)胞生長過程主要包括：延遲（適應(yīng)）期、指數(shù)生長期、減速期、平臺期和衰退期5個階段第十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一延遲期第十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一指數(shù)生長期第十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一減速期S:限制性基質(zhì)濃度Ks:飽和常數(shù)μ:比生長速率μm:最大比生長速率第十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一平臺期Xm:最大細(xì)胞濃度;Xo:接種時的細(xì)胞濃度So:限制性基質(zhì)接種時的濃度;μm:最大比生長速率K:常數(shù)第十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一四、細(xì)胞代謝與調(diào)控代謝產(chǎn)物關(guān)系糖類代謝與脂肪代謝之間的關(guān)系，糖類與蛋白質(zhì)代謝之間的關(guān)系，脂肪代謝與蛋白質(zhì)代謝之間的關(guān)系，核酸代謝與糖、脂肪、蛋白質(zhì)三者之間的關(guān)系代謝工程逆代謝工程第二十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一生物大分子：糖、脂類、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和脂類代謝取決于糖代謝的程度第二節(jié)物質(zhì)代謝的相互關(guān)系TCA：糖、脂肪和蛋白質(zhì)三大物質(zhì)互相轉(zhuǎn)化的樞紐物質(zhì)代謝---聯(lián)系---轉(zhuǎn)化關(guān)鍵代謝物：如G-6-P，丙酮酸、乙酰輔酶A6/5/202321第二十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一一、糖代謝與蛋白質(zhì)代謝的相互關(guān)系1）蛋白質(zhì)→AA，生糖AA→α-酮酸→糖（多數(shù)）AA脫氨→丙酮酸→糖異生→糖6/5/202322第二十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一2）糖→非必需AA，但不能合成必需AA糖代謝：為Pr合成提供碳源和能源6/5/202323第二十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一2、糖代謝與脂類代謝的關(guān)系饑餓：與糖尿病類似的情況6/5/202324第二十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一3、脂類代謝與蛋白質(zhì)代謝的關(guān)系脂類分解產(chǎn)生較多的能量→體內(nèi)貯藏能量的物質(zhì)脂類與蛋白質(zhì)之間可以相互轉(zhuǎn)化6/5/202325第二十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一4、核酸代謝與糖、脂肪及蛋白質(zhì)代謝的關(guān)系Gly、Asp、Gln嘌呤、嘧啶AMP輔酶、組氨酸等蛋白酶核苷酸、核酸的合成一碳基團(tuán)核苷酸、核酸的合成6/5/202326第二十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一酮體CO2尿素6/5/202327第二十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一大分子降解成基本結(jié)構(gòu)單位（構(gòu)造單元）構(gòu)造單元形成共同的中間產(chǎn)物（如丙酮酸、乙酰CoA等），產(chǎn)生NADPH、ATP中間物進(jìn)入TCA,徹底氧化H2O、CO2，產(chǎn)生大量ATP6/5/202328第二十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一第三節(jié)、代謝調(diào)控總論代謝調(diào)節(jié)的三級水平：

細(xì)胞/酶水平調(diào)節(jié)激素水平調(diào)節(jié)神經(jīng)水平調(diào)節(jié)多細(xì)胞整體水平調(diào)節(jié)代謝物通過影響細(xì)胞內(nèi)酶活力和酶合成量的變化，改變合成或分解代謝過程的速度內(nèi)分泌腺所分泌的激素通過體液輸送到一定組織，作用于靶細(xì)胞，改變酶活性而調(diào)節(jié)代謝反應(yīng)的方向和速度。CNS的控制下，通過神經(jīng)遞質(zhì)對效應(yīng)器發(fā)生直接影響，或者改變激素的分泌。6/5/202329第二十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一一、酶水平的調(diào)節(jié)酶水平調(diào)節(jié)酶活性調(diào)節(jié)（酶結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)）變（別）構(gòu)調(diào)節(jié)快速調(diào)節(jié)（微調(diào)）酶合成的誘導(dǎo)與阻遏

長期調(diào)節(jié)（粗調(diào)節(jié)）酶含量調(diào)節(jié)

（基因表達(dá)水平調(diào)節(jié)）化學(xué)修飾調(diào)節(jié)酶的降解（一）酶活力的調(diào)節(jié)6/5/202330第三十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一別構(gòu)效應(yīng)物別構(gòu)激活劑——別構(gòu)激活（正反饋）——增加活性別構(gòu)抑制劑——別構(gòu)抑制（負(fù)反饋）——降低活性底物、產(chǎn)物或ATP、ADP、AMP等1反饋抑制：限速酶受其代謝體系終產(chǎn)物的抑制。6/5/202331第三十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一6/5/202332第三十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一代謝物別構(gòu)中心活性中心反饋調(diào)節(jié)中酶活性調(diào)節(jié)的機(jī)制6/5/202333第三十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一氨基酸合成的反饋調(diào)控反硝化作用氧化亞氮氨甲酰磷酸分支酸脫氧庚酮糖酸-7-磷酸天冬氨酸天冬氨酰磷酸赤蘚糖-4-磷酸脫氫奎尼酸莽草酸谷氨酸磷酸烯醇式丙酮酸+預(yù)苯酸TryPheTrpIleTrpHisCTPAMPGlnLysMetThr酮丁酸GlyAla谷氨酰胺合酶天冬氨酰半醛高絲氨酸氨基苯甲酸協(xié)同反饋抑制順序反饋抑制6/5/202334第三十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一2、產(chǎn)能反應(yīng)與需能反應(yīng)的調(diào)節(jié)細(xì)胞能量狀態(tài)指標(biāo)0.85～0.95能荷<0.85，產(chǎn)能（分解）代謝加強(qiáng)能荷＞0.95，貯能（合成）代謝加強(qiáng)糖原葡萄糖CO2＋H2O＋ATP321ATP、ADP、AMP也是一種變構(gòu)劑6/5/202335第三十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一丙酮酸

G細(xì)胞液檸檬酸乙酰CoA檸檬酸草酰乙酸-酮戊二酸乙酰CoA丙酮酸線粒體

G-6-PF-6-PF-1.6-2P

磷酸果糖激酶PEPADP+PiATPADP+PiATP

NADH

O2ATP

ADP+PiAMP+ATP2ADP

PiPi

PEP羧激酶+++---++----

己糖激酶

丙酮酸脫氫酶

檸檬酸合成酶-酮戊二酸

脫氫酶糖酵解與TCA途徑的調(diào)節(jié)6/5/202336第三十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一3、酶的共價修飾和級聯(lián)系統(tǒng)（1）共價修飾（covalentmodification）：

酶蛋白肽鏈上的基團(tuán)在另一些酶的催化下可與某種化學(xué)基團(tuán)發(fā)生可逆的共價結(jié)合，從而改變酶的活性，這種改變酶活性的調(diào)節(jié)方式～（2）共價修飾的類型：磷酸化/去磷酸化（最常見），乙?；?去乙?；佘挣；?去腺苷酰化，尿苷?；?去尿苷?；谆?去甲基化，氧化（S-S）/還原(2SH)6/5/202337第三十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一6/5/202338第三十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一（3）特點

修飾過程，酶活性在無活性（低活性）與有活性（高活性）兩種狀態(tài)中互變共價修飾互變由不同的酶催化

快速調(diào)節(jié)激素信號啟動的共價修飾會引起級聯(lián)放大效應(yīng)6/5/202339第三十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一糖原磷酸化酶和糖原合成酶活性的調(diào)節(jié)6/5/202340第四十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期一受共價修飾調(diào)節(jié)的酶酶來源改變反應(yīng)對酶活力的影響糖原磷酸化酶真核細(xì)胞磷酸化/脫磷酸化+/-磷酸化酶b激酶哺乳類磷酸化/脫磷酸化+/-糖原合成酶真核細(xì)胞磷酸化/脫磷酸化-/+丙酮酸脫氫酶真核細(xì)胞磷酸化/脫磷酸化-/+谷氨酰胺合成酶原核細(xì)胞(大腸桿菌)腺苷酰化/脫腺苷?；?/+6/5/2023