端粒與端粒酶

端粒與端粒酶第一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

端粒（telomere）是真核生物染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)由端粒DNA和端粒蛋白質(zhì)構(gòu)成作用：穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)防止染色體末端融合保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)基因避免遺傳信息在復(fù)制過程中丟失第二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

端粒的發(fā)現(xiàn)1930年，著名的遺傳學(xué)家B.Mcclintock和HJ.Müller發(fā)現(xiàn)：染色體的末端可維持染色體的穩(wěn)定性；Müller將它定義為“telomere”，這是由希臘語“末端”（telos）及“部分”（meros）組成的；染色體失去了這些片段，就會(huì)互相粘連到一塊，發(fā)生結(jié)構(gòu)及功能上的改變，從而影響到細(xì)胞的分裂與生長。第三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

端粒的發(fā)現(xiàn)1970年，EH.Blackburn利用四膜蟲（Tetrahymena）揭示了端粒的初步結(jié)構(gòu)：由幾個(gè)核苷酸組成的DNA重復(fù)片段，富含G（TTGGGG）n，重復(fù)的次數(shù)由幾十到數(shù)千不等。第四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日分裂中期染色體結(jié)構(gòu)——

端粒端粒下區(qū)subtelomericregion與端粒DNA相鄰，由一些退化的端粒DNA片斷的重復(fù)組成第五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日端粒DNA序列人的端粒DNA序列長約5～15kb序列：（TTAGGG）n，串聯(lián)重復(fù)第六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日不同生物端粒DNA長度

酵母200—400bp尖毛蟲20bp小鼠5—80kb大鼠150kb第七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日端粒酶的發(fā)現(xiàn)1972年，JD.Watson發(fā)現(xiàn)：DNA聚合酶不能夠完整地復(fù)制線性染色質(zhì)；5’末端的引物脫落后，DNA聚合酶不能完成最后的復(fù)制，留下一個(gè)單鏈的間隙；如果這一間隙不能夠被填充，染色體DNA將失去這一DNA片斷；每經(jīng)過一次復(fù)制、分裂，染色體就將丟失一部分的端粒結(jié)構(gòu)，影響到與端粒相鄰的一些重要基因；科學(xué)家們考慮：可能存在著一種不同于DNA聚合酶的酶來完成單鏈間隙的復(fù)制。第八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日示意圖

第九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

端粒酶的發(fā)現(xiàn)1984，CW.Greider和EH.Blackburn發(fā)現(xiàn)：將一段單鏈的末端寡聚核苷酸加至四膜蟲的提取物中后，端粒的長度延長了，這就說明了切實(shí)有這樣的一種酶存在；將它命名為：“端粒酶”（telomerase）；進(jìn)一步的研究揭示了端粒與端粒酶在細(xì)胞的生長及腫瘤發(fā)生中有非常重要的意義，現(xiàn)正成為一個(gè)研究的熱點(diǎn)。第十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日端粒酶一種核糖蛋白酶，有三個(gè)主要組成部分人端粒酶RNA（humantelomeraseRNA，hTR）端粒酶相關(guān)蛋白（telomerase-associatedprotein，TP1/TLP1）人端粒酶催化蛋白亞單位（thecatalyticproteinsubunitoftelomerase，hTERT）第十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

端粒酶的結(jié)構(gòu)第十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

端粒酶是端粒復(fù)制所必須的一種特殊的DNA聚合酶；具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性；能以hTR為模板，向染色體末端添加TTAGGG序列。第十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日第十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日端粒酶的爬行模型（動(dòng)畫演示）第十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日端粒酶作用模式第十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日端粒酶作用模式第十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日端粒酶延伸端粒的機(jī)制第十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日端粒酶在大多數(shù)的正常人的體細(xì)胞中沒有活性近年來的研究發(fā)現(xiàn)：衰老者端?？s短；大約在85%-95%的腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到了端粒酶活性（端粒酶陽性）。提示：端粒、端粒酶與癌癥之間存在相關(guān)性？？？端粒、端粒酶與衰老之間存在相關(guān)性？？？端粒酶激活可能是細(xì)胞癌變（或永生化）的一個(gè)共同通路。第十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日端粒與衰老1973年，Olovnikov博士，首次提出：

——端粒丟失同衰老有關(guān)。端粒的丟失很可能是因?yàn)槟撤N與端粒相關(guān)的基因發(fā)生了致死性的缺失。第二十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

目前結(jié)論：細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的缺失，導(dǎo)致：端?？s短。端粒一旦縮短到短于某個(gè)“關(guān)鍵長度”，就很有可能導(dǎo)致：染色體雙鏈斷裂，并激活細(xì)胞自身的檢驗(yàn)系統(tǒng)，使細(xì)胞進(jìn)入M1期死亡狀態(tài)。隨著端粒的進(jìn)一步丟失，發(fā)生染色體重排，導(dǎo)致：無著絲粒染色體和非整倍體染色體的形成等，使細(xì)胞進(jìn)入M2期死亡狀態(tài)。第二十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

目前結(jié)論（續(xù)）：如果細(xì)胞要維持其正常分裂，就必須激活端粒酶，阻止端粒的進(jìn)一步丟失；否則，細(xì)胞不能進(jìn)行染色體的正常復(fù)制；只有重新獲得端粒酶活性的細(xì)胞，才能繼續(xù)生存下去；無法激活端粒酶的細(xì)胞（即無法阻止端粒進(jìn)一步丟失），只能面臨趨向衰老。第二十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

端粒丟失與衰老關(guān)系端粒丟失是衰老的原因？還是結(jié)果？目前的研究結(jié)果還處在探索階段，各種關(guān)于端粒/端粒酶參與細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)化的證據(jù)大多比較粗淺，而且，尚未被證實(shí)。第二十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

端粒、端粒酶與癌癥

研究染色體在腫瘤形成中的變化，發(fā)現(xiàn)：人惡性腫瘤細(xì)胞：均呈現(xiàn)端粒酶活性；正常體細(xì)胞：檢測(cè)不到端粒酶活性；統(tǒng)計(jì)資料表明：84.8%的惡性腫瘤具有活化狀態(tài)的端粒酶；僅在4.2%的正常組織、癌旁組織和良性腫瘤中端粒酶呈陽性；提示：端粒酶活性的變化與細(xì)胞惡化有關(guān)。第二十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日端粒酶活性升高可能引起癌癥對(duì)癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)：永生化是癌細(xì)胞所具有的顯著行為；端粒酶被激活的細(xì)胞也具有永生化行為；癌細(xì)胞具有端粒酶被激活的細(xì)胞所具備的特性；抑制端粒酶活性，使永生化細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檎＜?xì)胞。癌細(xì)胞通過分泌大量端粒酶來防止染色體端?？s短，以便不斷分裂繁殖。第二十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日端粒酶缺乏同樣會(huì)引起癌癥美國哈佛醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家：對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行了基因改造，使其體內(nèi)缺乏端粒酶以及一些抗癌蛋白質(zhì)（p53），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)鼠患上了鼠類通常不會(huì)患的人類癌癥——器官上皮細(xì)胞癌。研究表明：端粒酶缺乏同樣會(huì)引起癌癥。第二十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日Hiyama等人（1995），研究了100例成纖維神經(jīng)細(xì)胞瘤，發(fā)現(xiàn)：有端粒酶活性表達(dá)的腫瘤組織占94%；端粒酶活性越高的組織越容易伴有其它遺傳學(xué)變化，并且預(yù)后不良；低端粒酶活性的腫瘤組織中未見有相應(yīng)的變化，且都預(yù)后良好；甚至有3例處于IVS階段的無端粒酶活性的病例竟出現(xiàn)了腫瘤消退的現(xiàn)象；這似乎說明：端粒酶同癌癥之間存在著相關(guān)性，但是否是因果關(guān)系，還很難定論。第二十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

衰老端粒/端粒酶癌癥衰老可能是由端粒的縮短所致，激活端粒酶似乎可以阻止衰老?？墒?，端粒酶一旦被重新激活，細(xì)胞又將成為永生化細(xì)胞，繼而衍變?yōu)榘┘?xì)胞。如何能恰當(dāng)、正確的發(fā)揮端粒/端粒酶在解決衰老與癌癥中的作用？

生命科學(xué)領(lǐng)域一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的課題。第二十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

端粒抑制劑的研究Colorado大學(xué)的ThomasCech和RobertWeinbrg博士：已克隆出一種控制人類細(xì)胞端粒酶活性的基因；應(yīng)用這種基因，很有可能得到一種新的蛋白質(zhì)—端粒酶控制劑；目前，端粒酶控制劑直接用于人體試驗(yàn)還尚不成熟，但為人類征服癌癥以及其它的同衰老有關(guān)疾病的治療指了方向。第二十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日抑制端粒酶活性為靶點(diǎn)的腫瘤治療研究

主要策略有：①阻斷端粒酶RNA的模板作用②抑制端粒酶催化蛋白亞基③核苷類似物競爭性抑制反轉(zhuǎn)錄過程④細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑抑制端粒酶活性⑤對(duì)細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行調(diào)控⑥其它抑制劑對(duì)端粒酶活性的調(diào)節(jié)第三十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日抑制端粒酶活性

——阻斷端粒酶RNA的模板作用端粒酶是以其自身RNA為模板來合成端粒DNA序列，因此可以通過消除其模板作用抑制端粒酶活性，達(dá)到限制端粒合成的目的。消除端粒自身模板作用的方法：反義核苷酸封閉hTR反義肽核酸封閉hTR錘頭狀核酶切割hTR序列第三十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

反義核苷酸封閉hTR

端粒酶RNA序列中含有與端粒DNA互補(bǔ)的模板序列，因此可設(shè)計(jì)能與之結(jié)合的反義核苷酸來滅活端粒酶，從而阻止端粒序列的合成；Feng等首先用含反義hTR的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,經(jīng)過23～26倍增時(shí)間后，HeLa細(xì)胞進(jìn)入生長危機(jī)，并伴隨端粒長度的縮短和端粒酶活性的抑制。第三十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

反義核苷酸封閉hTR為了提高抗反義核酸降解和進(jìn)入組織細(xì)胞的能力，Piytts等設(shè)計(jì)了一種甲基化的反義RNA（2’-O-methyl-RNA），用陽性脂質(zhì)將其導(dǎo)入人前列腺腫瘤細(xì)胞系DU145，使細(xì)胞的端粒酶活性減少了97%；有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，用硫代反義核苷酸活性，還能抑制淋巴瘤細(xì)胞系OMABL1的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。第三十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

反義肽核酸封閉hTR

肽核酸（peptidenucleicacids,PNA）是一類人工合成的DNA或RNA類似分子；PNA與核酸分子的不同之處在于：將DNA中的磷酸脫氧核糖骨架被酰胺鍵連接的多肽骨架所代替，堿基通過亞甲羧基鏈與骨架中甘氨酸的氨基連接；PNA具有與天然DNA相類似的結(jié)構(gòu)特征和相同的DNA/RNA結(jié)合特性。第三十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

PNA與DNA結(jié)構(gòu)比較骨架由N-（2-氨基乙基）甘氨酸構(gòu)成堿基通過亞甲羧基鏈與骨架中甘氨酸氨基連接第三十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日PNA對(duì)DNA或RNA的親和力較相應(yīng)DNA與DNA和DNA與RNA之間的親和力高在100mmol/LNaCl溶液中，每堿基的Tm值約升高5℃；導(dǎo)致PNA-DNA雙鏈和PNA-RNA雙鏈的Tm值升高的原因是由于PNA-DNA和PNA-RNA中兩條單鏈之間缺乏靜電排斥力；PNA-DNA和PNA-RNA雙鏈的方向可以是同向平衡，也可以是反向平衡，反向平衡時(shí)Tm值更高。第三十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

不同鹽濃度對(duì)雜交分子Tm值的影響

NaCl濃度PNA/DNADNA/DNA

0mmol/L72℃38℃140mmol/L69℃56℃1000mmol/L65℃65℃

第三十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

反義肽核酸封閉hTRPNA不帶電荷，中性骨架間無排斥力，使之具有比DNA寡核苷酸更強(qiáng)的結(jié)合力和抗蛋白酶和核酸酶降解能力；Norton等，設(shè)計(jì)了針對(duì)hTR模板區(qū)的不同長度的PNA，發(fā)現(xiàn)其對(duì)端粒酶活性的抑制在一定長度范圍內(nèi)隨鏈的延長而增強(qiáng)；PNA的高度親和性、高度特異性和抗降解能力，使之成為極具潛力的抗腫瘤新藥。第三十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日

錘頭狀核酶切割hTR序列

核酶是一類具有酶活性的小分子RNA，通過序列特異性地與靶RNA分子配對(duì)，對(duì)底物進(jìn)行切割，從而使其失去生物學(xué)功能；Wan等，合成了一種甲基化修飾的錘頭狀核酶（2’-O-methyl-modifiedhammerheadribozymes），具特異性切割hTR模板區(qū)序列的功能。第三十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日核酶：四膜蟲rRNA自我剪切第四十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日錘頭狀核酶切割hTR序列將該酶與人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞系的細(xì)胞抽提物共同孵育，端粒酶活性受到明顯抑制，這種抑制作用具有劑量依賴效應(yīng)；Yokoyama等，設(shè)計(jì)了針對(duì)人端粒酶RNA模板區(qū)的錘頭狀核酶，能有效切割非細(xì)胞體系中的RNA底物，將其導(dǎo)入子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞后，可明顯抑制端粒酶活性。第四十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日抑制端粒酶活性

——抑制端粒酶催化蛋白亞單位Horikawa等發(fā)現(xiàn)：將正常人3號(hào)染色體導(dǎo)入人腎癌細(xì)胞系RCC23，可引起其端粒酶活性的抑制、端粒的進(jìn)行性縮短和細(xì)胞的老化，并且證實(shí)端粒酶活性的抑制是由于編碼hTERT的基因的下調(diào)引起的，提示：3號(hào)染色體上存在直接或間接控制hTERT基因表達(dá)的基因；最近大量研究表明：端粒酶三個(gè)主要組成成分中hTERT與腫瘤的關(guān)系最密切，已成功將其克隆；hTERT有望成為腫瘤基因治療的新的理想靶點(diǎn)。第四十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日抑制端粒酶活性

——核苷類似物競爭性抑制反轉(zhuǎn)錄

端粒酶具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，在催化合成端粒DNA的過程中，需要有4種dNTP的參與；利用核苷類似物競爭性抑制反轉(zhuǎn)錄過程抑制端粒酶活性阻止端粒延長。第四十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日抑制端粒酶活性

——核苷類似物競爭性抑制反轉(zhuǎn)錄Strahl等發(fā)現(xiàn)：雙脫氧鳥嘌呤核苷（dideoxyguanosine，ddG）可使永生化的人淋巴細(xì)胞株JY616和JurkatE6-1的端粒發(fā)生進(jìn)行性縮短和端粒酶活性的明顯抑制，而且ddGTP也有類似的抑制作用。第四十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日抑制端粒酶活性

——核苷類似物競爭性抑制反轉(zhuǎn)錄Melana等在培養(yǎng)基中加入疊氮脫氧胸苷（3’-azido-3‘-deoxythymidine，AZT），發(fā)現(xiàn)：乳腺癌細(xì)胞系（四種）T4白血病細(xì)胞出現(xiàn)生長抑制和端粒酶活性的抑制，但不同細(xì)胞系所需劑量不同。第四十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日抑制端粒酶活性

——細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑

分化不良的惡性腫瘤細(xì)胞端粒酶活性一般很高，但終末分化的正常人體細(xì)胞卻無端粒酶活性表達(dá)，這提示：細(xì)胞分化與端粒酶活性之間存在某種關(guān)系；Bestilny，等：研究發(fā)現(xiàn)，維甲酸（RA）、二甲亞砜（DMSO）和TPA（12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate）在誘導(dǎo)HL60白血病細(xì)胞等永生化細(xì)胞終末分化時(shí)，可明顯抑制細(xì)胞端粒酶活性，并使凋亡細(xì)胞增多。但這些誘導(dǎo)劑本身并不能直接抑制端粒酶活性，提示：端粒酶活性的下調(diào)是細(xì)胞分化所造成的。第四十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日抑制端粒酶活性

——細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑Sharma，等：將DMSO作用于Brukitt淋巴瘤Raji細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生可逆性G0/G1停滯，并有端粒酶活性的抑制；楊驊，等：分別用維甲酸和苦參堿間接抑制了大腸癌細(xì)胞和紅白血病細(xì)胞株K562的端粒酶活性，這種抑制作用的機(jī)制目前尚不清楚。第四十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日抑制端粒酶活性

—對(duì)細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行調(diào)控

目前的研究表明：端粒酶活性受多種細(xì)胞內(nèi)機(jī)制的調(diào)節(jié)，故對(duì)這些調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行調(diào)控也能有效地抑制端粒酶活性；Fujimoto，等：將與c-mycmRNA互補(bǔ)的反義寡核苷酸作用于三種人白血病細(xì)胞系HL60、U937和K562細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)：三種細(xì)胞的端粒酶活性都有明顯下調(diào)。第四十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日抑制端粒酶活性

—對(duì)細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行調(diào)控Mandal，等：發(fā)現(xiàn)：在IL-2依賴的細(xì)胞毒T細(xì)胞系CTLL-2細(xì)胞中，下調(diào)凋亡相關(guān)基因Bcl-2的表達(dá)可引起端粒酶活性的抑制，而Bcl-2的過度表達(dá)則可引起腫瘤細(xì)胞端粒酶活性的明顯升高。第四十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日抑制端粒酶活性

——其它抑制劑對(duì)端粒酶活性的調(diào)節(jié)端粒酶活性也受其它一些抑制劑的調(diào)節(jié)如蛋白激酶抑制劑和DNA交聯(lián)劑Stao，等：發(fā)現(xiàn)：高濃度生物堿9-HE（9-hydroxyellipticine，一種蛋白激酶抑制劑），可快速、完全地抑制端粒酶活性；提示：端粒酶蛋白亞基的磷酸化及去磷酸化可能參與端粒酶活性的調(diào)節(jié)。第五十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日抑制端粒酶活性

—其它抑制劑對(duì)端粒酶活性的調(diào)節(jié)最近，Li，等：證實(shí)：人端粒酶蛋白組分hTP1和hTERT都是磷酸蛋白，其磷酸化是人乳腺癌細(xì)胞端粒酶活化的必要條件；Kang，等：證實(shí)：hTERT是激酶Akt的底物蛋白，hTERT肽鏈的磷酸化可引起端粒酶活性的上調(diào)。第五十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期日抑制端粒酶活性

——其它抑制劑對(duì)端粒酶活性的調(diào)節(jié)以上研究表明：蛋白激酶抑制劑可有效阻斷端粒酶蛋白的磷酸化，從而抑制端粒酶活性；Burger，等：發(fā)現(xiàn)：DNA交聯(lián)劑cisplatin（順鉑）可抑制人睪丸癌細(xì)胞端粒酶活性，且這種抑制作用具有濃度依賴性；Ishibashi，研究也得到類似結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)：較高劑量的順鉑對(duì)端粒酶活性的抑制可能是由于TTAGG重復(fù)序列的交聯(lián)，也可能是順鉑作用