高中生物選修三基因工程

§1-1DNA重組技術(shù)的基本工具一、基因工程的概念基因工程是指按照

，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，并通過

和

技術(shù)，賦予生物以新的

，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的

和

?；蚬こ痰膭e名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結(jié)果DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平獲取基因—體外重組—導(dǎo)入基因—表達(dá)基因人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品人們的意愿DNA重組轉(zhuǎn)基因遺傳特性生物類型生物產(chǎn)品二、DNA重組技術(shù)的基本工具限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”

DNA連接酶——“分子縫合針”

載體——“分子運輸車”

識別某種雙鏈DNA分子特定的核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要是從原核生物中分離純化而來1、來源：2、作用：3、特點：4、結(jié)果：片段的末端的形式

黏性末端平末端(一）限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）---“分子手術(shù)刀”特異性----特定序列、特定位點形成DNA的雙鏈片段（二）DNA連接酶---“分子縫合針”1、種類：2、作用部位：兩類E·coliDNA連接酶:連接黏性末端T4DNA連接酶：連接黏性末端和平末端磷酸二酯鍵2、運載體必須具備的條件：（1）具有一個或多個限制酶切點，以便與目的基因連接；（2）能夠在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存，以便目的基因的遺傳；（3）具有某些標(biāo)記基因，以便進(jìn)行重組DNA的篩選。（如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等）；（4）對受體細(xì)胞無害；（5）

大小合適，以便提取和體外操作。1、運載體的作用：（1）將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去；（2）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳；（3）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。（三）運載體---“分子運輸車”質(zhì)粒是基因工程最常用的運載體，它廣泛地存在于細(xì)菌中，是細(xì)菌擬核DNA外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子，大小只有普通細(xì)菌擬核DNA的百分之一。要對天然質(zhì)粒進(jìn)行人工改造常用的運載體有：

質(zhì)粒，λ噬菌體的衍生物，動植物病毒等1.以下說法正確的是（）A、所有的限制酶只識別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體C、運載體必須具備的條件之一是：具有一個或多個限制酶切點，以便與外源基因連接D、DNA連接酶使黏性末段的堿基之間形成氫鍵C練習(xí)2.不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是（）

A、能復(fù)制

B、有多個限制酶切點

C、具有標(biāo)記基因

D、它是環(huán)狀DNAD練習(xí)3.有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（）

A、基因工程技術(shù)能定向地改造生物的遺傳性狀，培育生物新品種

B、重組DNA的形成在生物體外完成

C、目的基因須由運載體導(dǎo)入受體細(xì)胞

D、質(zhì)粒都可作為運載體D練習(xí)練習(xí)①???CTGCA???G⑤G???ACGTC???②???AC???TG③GC???CG???④???G???CTTAA⑥???GC???CG⑦GT???CA???⑧AATTC???G???2.2基因工程的基本操作程序第5章生態(tài)系統(tǒng)及其穩(wěn)定性基因工程的基本操作程序主要包括四個步驟：1、

；2、

；3、

；4、

。其中核心是

。目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定基因表達(dá)載體的構(gòu)建一、獲取目的基因1、目的基因：在基因操作中使用的外源基因。它主要是

的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。編碼蛋白質(zhì)一、獲取目的基因2、獲取方法：（1）從基因文庫中獲取基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫?；蛭膸旎蚪M文庫---包含一種生物的所有基因部分基因文庫---包含一種生物的部分基因

（如cDNA文庫）一、獲取目的基因2、獲取方法：（1）從基因文庫中獲取基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和比較一、獲取目的基因2、獲取方法：（1）從基因文庫中獲取從構(gòu)建好的基因文庫中獲取目的基因：

依據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，以及基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。一、獲取目的基因2、獲取方法：（2）用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR技術(shù)：在生物

復(fù)制特定

的核酸合成技術(shù)。體外DNA片段PCR技術(shù)原理：

。DNA雙鏈復(fù)制55℃-60℃：

與單鏈模板相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合；一、獲取目的基因2、獲取方法：（2）用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因90℃-95℃：目的基因的雙鏈模板在熱力作用下，

斷裂，形成單鏈DNA;氫鍵引物過程：70℃-75℃：在

作用下進(jìn)行延伸。DNA聚合酶（Taq酶）一、獲取目的基因2、獲取方法：（2）用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR技術(shù)的條件：模板：原料：引物：酶：溫度控制：目的基因兩條鏈四種游離的脫氧核苷酸（一小段與目的基因模板鏈互補(bǔ)的）一對DNA單鏈熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）高溫→低溫→中溫一、獲取目的基因2、獲取方法：（2）用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR結(jié)果：使目的基因以

形式在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增。指數(shù)一、獲取目的基因2、獲取方法：（3）用化學(xué)方法人工合成如果基因比較小，

又已知，可以通過

用化學(xué)方法直接人工合成核苷酸序列DNA合成儀二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1、目的：（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以

給下一代；（2）使目的基因能夠

和發(fā)揮作用遺傳表達(dá)二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建2、過程：載體目的基因同一種限制酶具有黏性末端的載體具有相同黏性末端的目的基因重組DNA分子DNA連接酶（重組載體）二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、組成：啟動子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因+(復(fù)制原點）三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化的概念2、轉(zhuǎn)化的方法植物：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法動物：顯微注射技術(shù)微生物：Ca2+處理法此外還有3、轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞植物：常用體細(xì)胞動物：受精卵微生物：常用大腸桿菌、酵母菌等四、目的基因的表達(dá)和鑒定1、導(dǎo)入的鑒定：DNA分子雜交技術(shù)2、轉(zhuǎn)錄的鑒定：核酸分子雜交技術(shù)3、翻譯的鑒定：抗原-抗體雜交技術(shù)4、個體水平的鑒定：抗蟲、抗病等的感染、接種實驗分子水平鑒定T磷酸二酯鍵A

大腸桿菌(EcoRI)的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。限制酶所識別的序列有什么特點?限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個、8個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。黏性末端黏性末端黏性末端：被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口叫黏性末端。

平末端：當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。。當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線兩側(cè)切開時，產(chǎn)生的是黏性末端。當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，產(chǎn)生的是平末端能帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點標(biāo)記基因的作用鑒別受體細(xì)胞中是否含目的基因。如將來可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別，將含目的基因的細(xì)胞篩選出來。PCR技術(shù)—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)①概念：②原理：③前提：PCR擴(kuò)增儀DNA雙鏈復(fù)制的基本原理一段已知的目的基因的核苷酸序列是一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)四種脫氧核苷酸一對引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(含有目的基因)溫度控制④條件：⑤方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑥結(jié)果：目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增指數(shù)2n⑦過程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈復(fù)制原點+啟動子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因重組（基因表達(dá)）載體的結(jié)構(gòu)組成啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來限制酶在原核生物中的作用

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要