利用實時定量-PCR技術通過-△△CT-方法分析相對基因表達差異優(yōu)質資料

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利用實時定量PCR技術通過2-△△CT方法分析相對基因表達差異利用實時定量PCR技術通過-△△CT方法分析相對基因表達差異優(yōu)質資料(可以直接使用，可編輯優(yōu)質資料，歡迎下載）KennethJ.LivakandThomasD.SchmittgenDepartmentofPharmaceuticalSciences,CollegeofPharmacy.WashingtonStateUniversity,Washington99164-6534現(xiàn)在最常用的兩種分析實時定量PCR實驗數(shù)據(jù)的方法是絕對定量和相對定量。絕對定量通過標準曲線計算起始模板的拷貝數(shù)；相對定量方法則是比較經過處理的樣品和未經處理的樣品目標轉錄本之間的表達差異。2-△△CT方法是實時定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法。本文介紹了該方法的推導，假設及其應用。另外，在本文中我們還介紹了兩種2-△△CT衍生方法的推導和應用，它們在實時定量PCR數(shù)據(jù)分析中可能會被用到。關鍵詞：反轉錄PCR定量PCR相對定量實時PCRTaqman反轉錄PCR（RT-PCR）是基因表達定量非常有用的一種方法（1－3）。實時PCR技術和RT-PCR的結合產生了反轉錄定量PCR技術（4，5）。實時定量PCR的數(shù)據(jù)分析方法有兩種：絕對定量和相對定量。絕對定量一般通過定量標準曲線來確定我們所感興趣的轉錄本的拷貝數(shù)；相對定量方法則是用來確定經過不同處理的樣品目標轉錄本之間的表達差異或是目標轉錄本在不同時相的表達差異。絕對定量通常在需要確定轉錄本絕對拷貝數(shù)的條件下使用。通過實時PCR進行絕對定量已有多篇報道（6－9），包括已發(fā)表的兩篇研究論文（10，11）。在有些情況下，并不需要對轉錄本進行絕對定量，只需要給出相對基因表達差異即可。顯然，我們說X基因在經過某種處理后表達量增加2.5倍比說該基因的表達從1000拷貝/細胞增加到2500拷貝/細胞更加直觀。用實時PCR對基因表達進行相對定量分析需要特殊的公式、假設以及對這些假設的驗證。2-△△CT方法可用于定量PCR實驗來計算基因表達的相對變化：2-△△CT公式的推導,以及實驗設計，有效性評估在AppliedBiosystemsUserBulletinNo.2(P/N4303859)中有介紹。用2-△△CT方法分析基因表達數(shù)據(jù)在文獻中也有報道(5,6)。本文介紹了該方法的推導、假設以及應用。另外，本文還介紹了2-△△CT兩種衍生方法的推導和應用，它們在實時定量PCR數(shù)據(jù)分析中都可能被用到。?

2-△△CT方法?

2-△△CT方法的推導PCR指數(shù)擴增的公式是：Xn是第n個循環(huán)后目標分子數(shù)。X0是初始目標分子數(shù)。Ex是目標分子擴增效率。n是循環(huán)數(shù)CT代表目標擴增產物達到設定閾值所經歷的循環(huán)數(shù)因此：XT是目標分子達到設定的閾值時的分子數(shù)。CT,X是目標分子擴增達到閾值時的循環(huán)數(shù)。Kx是一個常數(shù)對于內參反應而言，也有同樣的公式：用XT除以RT得到：對于使用Taqman探針的實時擴增而言，XT和RT的值由一系列因素決定：包括探針所帶的熒光報導基團、探針序列對探針熒光特性的影響、探針的水解效率和純度以及熒光閾值的設定。因此常數(shù)K并不一定等于1。假設目標序列與內參序列擴增效率相同：或：XN代表經過均一化處理過的初始目標分子量；△CT表示目標基因和內標基因CT值的差異（CT,X-CT,R）整理上式得：最后用任一樣本q的XN除以參照因子（calibrator，cb）的XN得到：在這里對于一個少于150bp的擴增片斷而言，如果Mg2+濃度、引物都進行了適當?shù)膬?yōu)化，擴增效率接近于1。因此目標序列的量通過內均一化處理之后相對于參照因子而言就是：1.2方法的假設和應用要使△△CT計算方法有效，目標序列和內參序列的擴增效率必須相等?？磧蓚€反應是否具有相同的擴增效率的方法是看他們模板濃度梯度稀釋后擴增產物△CT如何變化。圖1顯示的是cDNA樣品在100倍稀釋范圍內的實驗結果。對于每一個稀釋樣本，都用GAPDH和c-myc特異的熒光探針及引物進行擴增。計算出c-myc和GAPDH的平均CT值以及△CT值，通過cDNA濃度梯度的log值對△CT值作圖，如果所得直線斜率絕對值接近于0，說明目標基因和內標基因的擴增效率相同，就可以通過△△CT方法進行相對定量。在圖1中，直線斜率是0.047，因而假設成立，△△CT方法可以用來分析數(shù)據(jù)。如果兩個擴增反應效率不同，則需要通過定量標準曲線和絕對定量的方法來進行相對定量；或者也可以重新設計引物，優(yōu)化反應條件使得目標序列和內參序列具有相同的擴增效率。1.3內標和參照因子的選擇使用內標基因的目的是為了對加入到反轉錄反應中的RNA進行均一化處理。標準的看家基因一般都可被用作內標基因。適合于實時PCR反應內標基因包括GAPDH，β-actin,β2-microglobulin以及rRNA。當然，其它的看家基因也同樣能被用作內標。我們推薦在應用某一基因作為內標之前首先確證該基因的表達不會受實驗處理的影響。驗證實驗處理是否對內標基因表達產生影響的方法在2.2部分有描述。方法中參照因子的選擇決定于基因表達定量實驗的類型。最簡單的設計就是把未經處理的樣品作為參照因子（calibrator）。經內標基因均一化處理后，通過方法計算，目標基因表達差異通過經過處理的樣本相對于未經處理的樣本的倍數(shù)來表示。對于未經處理的參照樣，△△CT＝0，而20＝1。所以根據(jù)定義，未處理樣本的倍數(shù)變化為1。而對于那些經過處理的樣本，相對于參考因子基因表達的倍數(shù)為。同樣的分析也可用于不同時相的基因表達差異，在這種情況下，一般選0時刻的樣本作為參照因子。有些情況下，并不是比較不同處理樣本基因表達差異。例如，有的是想看某一器官中特定mRNA的表達。在這種情況下，參照因子可能是另一器官中該mRNA的表達。表1顯示了大腦和腎臟總RNA中c-myc和GAPDH轉錄本的CT值。在這一個例子中，大腦被人為的選擇為參照因子，通過計算得到腎臟c-myc表達量經GAPDH校正后相對于大腦的表達量的結果。盡管相對定量方法可用于這種組織之間的比較，但結果的生物學解釋是相當復雜的。不同種類細胞中目標和參照轉錄本單一的相對量變化可能在任何特定的組織中都存在。

1.4方法的數(shù)據(jù)分析實時定量PCR所得到CT值可以很容易的輸出到表格程序如MicrosoftExcel中去。為了顯示數(shù)據(jù)分析過程，我們在這里給出了一個基因表達定量的實驗數(shù)據(jù)和樣本列表。通過β-actin均一化處理，我們對目標基因fos-glo-myc的表達變化進行了監(jiān)測。在8h的時間范圍內，在每一時間點都取3個重復樣本，每一樣本在cDNA合成之后都做定量PCR，數(shù)據(jù)分析用到了公式9，即：Timex表示任意時間點，Time0表示經β-actin校正后1倍量的目標基因表達。0時刻目標基因和內標基因的平均CT（見圖2第8欄）被用于公式9中。通過公式9計算出每一個樣本目標基因表達通過β-actin均一化處理后相對于0時刻的倍數(shù)（見圖2第9欄）。平均SD，CV由每一個時間點所取的三個重復樣求得。用這種分析方法，在0時刻的平均倍數(shù)變化接近于1。我們發(fā)現(xiàn)通過檢測在0時刻平均倍數(shù)變化是否為1可以很方便的驗證三個重復樣品之間是否有錯誤或者誤差。如果得到的結果與1偏差很大,則表明存在計算錯誤或者是很高的實驗誤差。在前面的例子中，在每一時間點上分別取了三個獨立的RNA樣本進行了分析。因此對每一個樣本分別處理，通過計算后取結果的平均值就非常重要。如果是同一樣本進行PCR擴增的重復，這就需要首先求出平均CT,然后再進行計算。怎么樣計算平均值就要看目標基因和內參基因是在同一個管子中擴增還是在不同的管子中擴增。表1給出了目標基因（c-myc）和內參基因（GAPDH）在不同管中擴增的實驗數(shù)據(jù)。在這里不應該把任一單個的c-myc管子和GAPDH管子作比較，而應該分別計算出c-myc和GAPDH的平均CT來計算△CT。重復實驗中CT值的估計偏差通過標準的指數(shù)計算轉化成最后結果中相對量的變化。但其中的一個難點是CT值與相應的拷貝數(shù)成指數(shù)關系（見第4部分）,因此，在最后的計算中，的誤差通過△△CT加上標準偏差和△△CT減去標準偏差來評估，這就使得求得的數(shù)值相對于平均值呈不對稱分布。不對稱分布是因為結果經指數(shù)處理后轉化成量的線性比較造成的。通過不同熒光染料標記的探針，我們可以在同一管中同時擴增目標序列和內標序列。表2給出了目標基因（c-myc）和內標基因（GAPDH）在同一管中擴增的實驗數(shù)據(jù)。對于任意一個管子，目標基因（c-myc）和內參基因（GAPDH）擴增時加入的cDNA量都是一樣多的，所以可以分別對每個管子計算△CT值，這些值取平均后再進行計算。在這里估計誤差值也是一個不對稱的范圍，反映了誤差經指數(shù)處理轉化為線性差異。在表1和表2中，估計誤差在從△CT到△△CT的計算中未見有增加，這是因為我們把參照基因和檢測基因的誤差都顯示出來了。我們把△CT,cb當作一個人為設定的常數(shù)來減去，得到△△CT。這樣得到的結果就與圖2所顯示的在求平均之前對不同重復樣本分別通過各自的CT值求所得結果相當。另一種方法是將參照基因當作沒有任何誤差的１倍的量，在這種情況下，平均△CT,cb的誤差值被引入到每一樣本的△△CT中。在表１中，腎臟中△△CT變成－2.50±0.20而經過校正的c-myc量是5.6倍，范圍從4.9到5.6。而在大腦中的結果是沒有誤差的１倍。2.2-ΔCT’方法2.12-△CT’方法的推導通過內標RNA可以對加入RNA的量的差異進行校正。方法的數(shù)據(jù)分析的一個特點就是能夠利用實時PCR實驗的一部分數(shù)據(jù)來完成這種校正。在其它的方法不能定量初始RNA量的時候：例如，在能得到的RNA量非常有限的時候或者需要處理高通量的樣品的時候，這一方法的優(yōu)勢就格外明顯。當然我們也可以利用PCR實驗以外的方法來完成這種校正。最常用的一種方法就是用紫外吸收來確定用于cDNA合成的RNA量，然后將相同的RNA反轉錄產生的cDNA用于PCR定量反應。這種外標法校正的一個應用例子就是研究某種實驗處理是否影響內標基因的表達。在這里，目標基因和內標合二為一。在這個例子中，公式[2]不被公式[3]除，公式［5］變成：整理得：任一樣品Ｘ0,q除以參照品X0,cb得：在這里△CT’=CT,q-CT,cb?！鰿T’與前面計算中用的△CT（用目標基因CT值減去參照基因CT值）相互區(qū)別。就象在1.1部分所描述的，如果條件優(yōu)化較好，效率接近于1，內標相對于參照因子為：2.22-△CT’方法的應用2-△CT，方法的一個應用就是確定實驗處理對某一候選內標基因的影響。為了顯示這一過程，我們做了血清饑餓/誘導實驗(7)。血清饑餓/誘導是研究某些mRNA降解的常用方法(8)。然而，血清可能影響一些基因的表達包括標準的看家基因的表達。在24-h血清饑餓培養(yǎng)之后，在NIH3T3細胞中加入15%血清誘導基因表達。從細胞中提取Poly(A)+RNA，并將之反轉錄成cDNA。利用SYBRGreen通過實時定量PCR檢測GAPDH，β2-microglobulincDNA的量。GAPDH和β2-microglobulin各自的相對量通過2-△CT‘公式求得。細胞處理對于GAPDH的基因表達有明顯影響，但對β2-microglobulin沒有什么影響。因此β2-microglobulin很適合做血清刺激定量實驗的內標，而GAPDH并不適合。這一例子向大家展示了在只研究一個基因的時候怎么用2-△CT‘的方法分析基因相對表達數(shù)據(jù)。3.實時PCR數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析實時PCR最終分析的是閾值循環(huán)或C。CT值通過PCR信號的對數(shù)值和循環(huán)數(shù)來確定。因此CT值是一個指數(shù)而非線性概念。因此，在任何統(tǒng)計分析中都不要用原始的CT值來表示結果。正如我們在前文中所描述的一樣，PCR相對量通常和內標和參照樣本一起計算而很少直接用CT值來表示，除非我們想檢驗重復樣本之間的差別。為了向大家顯示這一點，我們用SYBRGreen通過real-timePCR來檢測相同cDNA的96個重復反應。所有反應組分在同一管中混好后分裝到96個管中，做實時PCR分析，得到了每一個樣本的CT值。為了比較樣品間變化，計算了96個樣本的平均±SD，如果通過原始CT值計算，平均±SD是20.00±0.193，CV為0.971%。但是如果把原始Ct值用2-CT轉化成線性形式，平均±SD是9.08×10-7±1.33×10-7，CV為13.5％。從這個簡單的例子我們可以看出，通過原始CT值來反映變化是錯誤的，應該避免。用2-CT將單個數(shù)據(jù)轉化成線性形式來說明重復樣本之間的變化和差異更準確可靠。結論：實時定量PCR實驗設計和數(shù)據(jù)分析可以采用相對定量和絕對定量兩種方法，研究人員在設計實時定量PCR實驗分析基因表達的時候首先要問的一個問題就是：數(shù)據(jù)最后會以一個什么樣的形式得到。如果需要知道絕對的拷貝數(shù)，就必須用絕對定量的方法，否則只需要給出基因表達相對量就足夠了。相對定量可能比絕對定量要更容易一些，因為它不需要作標準曲線。本文所給出的公式對于每個用相對定量的方法分析基因表達差異的研究人員都足夠了。下面，我們總結一下實驗設計和評估中的一些重要步驟：?

選擇一個內標基因。?

確定內標的有效性，確保它不會受到實驗處理的影響。?

通過PCR擴增目標基因和內標基因RNA或cDNA的一系列梯度稀釋模板確保它們的擴增效率相同。最后通過2-△CT計算將統(tǒng)計數(shù)據(jù)轉化成線性形式而不是原始CT值。基因頻率和基因型頻率的計算基因頻率和基因型頻率的計算（一）。根據(jù)基因型或基因型頻率計算基因頻率：例1。從某個種群中隨機抽出１00個個體，測知基因型為AA，Aa和aa的個體分別是30、60和10個，求ａ的基因頻率。解析：可以通過基因型頻率計算基因頻率。一對等位基因中的一個基因的頻率：基因頻率(Ａ)=對應純合子(AＡ）基因型頻率＋雜合子（Aａ）基因型頻率的1/２。１00個個體中ＡA為３0個,Aa為６０個，ａa為10個，則AA這種基因型的頻率為30÷100=30％；同理，Aa為60％,aa為１0%,則A基因的基因頻率為30％+60％×1／２=60％,ａ基因的基因頻率為10％＋60％×1／2=４0％。答案:A基因的基因頻率為６0％，a基因的基因頻率為40％。變式訓練1．已知人眼的褐色（A）對藍色（a)是顯性，屬常染色體上基因控制的遺傳。在一個300０0人的人群中，藍眼的有3６0０人，褐眼的有26400人,其中純合子有12000人，那么，這一人群中A和a基因的基因頻率分別為—-——--－－———-—--——－—-－—-——－——--—-（）Ａ．64%和36％B.3６%和64％C．５0%和５0％Ｄ．８2％和1８%（二）.在伴性遺傳中有關基因頻率的相關計算：﹡例２.若在果蠅種群中,XB的基因頻率為９0％，Xb的基因頻率為1０％，雌雄果蠅數(shù)相等，理論上ＸbXb、XｂY的基因型比例依次為--－－-——----—-——-－－-－——--－-－－-－-—---—-－--－——-()Ａ.1％、2％B.0。５％、５％C。１0％、10％D．5%、0．5%解析：由于在該果蠅種群中，雌雄果蠅數(shù)相等,所以雌果蠅產生的配子中，XB的基因頻率應為9０％,Xｂ的基因頻率為10%。雄果蠅產生的配子中,有約1/2的含Y染色體的配子，另有約1/2的含X染色體的配子,在含Ｘ染色體的雄配子中，ＸＢ與Xb的基因頻率也分別為９0％和１0%。它們配子的結合情況可從下表中得出:雄配子雌配子Y（1/２)XＢ（1/2）×９０%Xb(１／2）×10%ＸB90％XBY45%XBXB4０．５％XBXb4．５％Xｂ10％XbY５％XBＸb4.5％XｂXｂ0．5％可見,理論上XBＹ基因型比例為45％，XbY的為5％，ＸBXb的為9%，XｂXb的為０.5％。答案：B。變式訓練2．對某校學生進行紅綠色盲遺傳病調查研究后發(fā)現(xiàn)：78０名女生中有患者23人，攜帶者52人，820名男生中有患者6５人,那么該群體中紅綠色盲基因的頻率是-—－--－()A。４。4％Ｂ。５.１％C.6.８%D。10．2％（三)．利用遺傳平衡定律求解基因頻率和基因型頻率1.對遺傳平衡的理解：遺傳平衡指在一個極大的隨機交配的種群中，在沒有突變發(fā)生,沒有自然選擇和遷移的條件下，種群的基因頻率和基因型頻率在一代一代的遺傳中可以世代保持不變。在遺傳平衡的種群中，某一基因位點上各種不同的基因頻率之和以及各種基因型頻率之和都等于是1。２．遺傳平衡定律公式的推導和應用在一個遺傳平衡的自然種群中,一個位于常染色體上的顯性基因A的基因頻率為p,與其相對應的隱性基因a的頻率為q,則該種群的后代中ＡA、Aａ、aａ的基因型頻率各是多少？三種基因型頻率之和為多少?分析：依題意，在一個遺傳平衡的自然種群中,顯性基因A的基因頻率與隱性基因a的基因頻率之和（p+q）應等于1，其雌雄個體向后代傳遞基因A型配子的頻率為ｐ，與其相對應的傳遞隱性基因ａ型配子的頻率為q,則可用下表表示各類配子的組合類型、子代基因型及其出現(xiàn)的概率:雄配子雌配子Ａ（p)a（q）A（p)ＡA（p２)Aa（pq）a（q）Aa（pｑ）Aa(q2）可以得出該種群后代中出現(xiàn)三種基因型AA、Aa、aa，并且三種基因型出現(xiàn)的頻率分別為ｐ2、2ｐｑ、q2，且它們的頻率之和為p2+２pｑ＋q2=(p+q)2=1。又因為該種群是一個處于遺傳平衡的自然種群,所以其種群特征應與此一致。這樣學生就很容易理解遺傳平衡定律了。例3．囊性纖維變性是一種常染色體遺傳病。據(jù)統(tǒng)計，在某歐洲人群中，每２500個人中就有一個患此病.現(xiàn)有一對健康的夫婦生了一個患有此病的孩子，此后,該婦女又與健康的男子再婚.則該再婚的雙親生一孩子患該病的概率是多少——-—－—--———－-－———－——--－(）A．1／2５B.１/５０Ｃ.1/100Ｄ．1/６25解析：由于雙親正常,卻生一病孩，可推知囊性纖維變性屬于常染色體隱性遺傳病,如把其控制基因記作a，則該婦女的基因型為Ａａ，這個婦女（Aa)與另一健康男子結婚,如若也生一病孩,則此健康男子必須是雜舍子（A)才有可能,所以解答本題的關鍵就在于求出該健康男子是雜合子的概率。根據(jù)題意，如果設基因ａ的頻率為ｑ，則有基因型aa的頻率=q×q=1／2500,可得q=1/50,基因A的頻率p=１一ｑ＝４9/５0.這樣雜合子Aa的基因型頻率=2pq＝２×49／５0×1／50≈１/25,又考慮到雙親均為雜合子時后代出現(xiàn)隱性純合子aa的可能性是1／4，由此可算出再生一孩患病的可能性為1／2５×１／4＝1／１0０.答案：C。變式訓練3．已知苯丙酮尿癥是位于常染色體上的隱性遺傳病。據(jù)調查，該病的發(fā)病率大約為1/１00００，請問在人群中該丙苯酮尿癥隱性致病基因（ａ）的基因頻率以及攜帶此隱性基因的攜帶者（Aa)基因型頻率分別是-———－－-－—————--－－－－—－-—-——--—--—-－—--—--（）A．１％和0。９９%B．１%和１。98%C。1%和3。9６％D．1%和０。198%例4.玉米的黃粒(Ｒ)對白粒(r）是顯性?，F(xiàn)將純合的黃色玉米和白色玉米交雜，得Ｆl全是黃色，F(xiàn)1的黃色玉米自交得F2。讓F２代的黃粒玉米之間隨機交配，則其子代F３中黃粒與白粒玉米的比為：Ａ．1:1B．2:1Ｃ．3：1D.8:１解析：解此題用基因頻率的方法計算就簡單多了。在F2的黃粒玉米中，基因型RR占1／3，Rｒ占２／３,所以在群體中產生的雌配子基因型有二種即Ｒ和r，其中含基因R的配子比例為2/３，含基因ｒ的配子比例為1/3；雄配子中含基因R的配子比例為２／3，含基因ｒ的配子比例為1／３。由于F２代的黃粒玉米之間隨機交配，雌雄配子的結合是隨機的，可以用下表表示：黃粒F２的配子雌配子R（2／3)雌配子ｒ（1／3)雄配子R(2／3)RＲ（4／９)Rr（2／9）雄配子r（１/３）Rr(2/9）rr（1／9）從上表可得出子代F3的表現(xiàn)型及比例為:黃粒(ＲR，Ｒr)8／9,白粒（rr）1／9。答案：Ｄ。變式訓練4.某豌豆基因型為Dd，讓其連續(xù)兩代自花授粉后，進行人工隨機授粉，則隨機授粉后的子代中dd占的比例為-－---－-—－——-－－—－－—－－--———－-－—－———--————-—--——（)A.１/4B.1/9C．9/６4D.６／6４三．反饋訓練:１.（２007年江蘇高考第15題）果蠅的體色由常染色體上一對等位基因控制，基因型BB、Bb為灰身,bb為黑身。若人為地組成一個群體，其中80％為BＢ的個體,20％為ｂb的個體，群體隨機交配,其子代中Ｂｂ的比例是A。２5％Ｂ.３2％C．50％D．64%2.如果在一個種群中，基因型AA的比例占25％，基因型Aa的比例占50％,基因型ａａ的比例占2５%。已知基因型aａ的個體失去求偶繁殖能力,則隨機交配一代后，子代中基因型aａ的個體所占的比例為－—－—-－———－—-－－-———－-－——-—--—--—－----———-－-－－－-—-——－-－－（）A。1/16Ｂ.1/8C．１／9D．３。假設某中心血防站調查了1７８8個MN血型血樣本，其中397人是M型（LMLM）,86１人是MN型(ＬMＬＮ),５30人是N（ＬＮＬＮ）型，則LＭ和LN的基因頻率分別是—--－————---－－()A．43．７%、56．3%B.56．3％、43。7%C。５3。7％、46。3%D．４6。3％、53.7％4.（２007年廣東高考第2０題）某常染色體隱性遺傳病在人群中的發(fā)病率為１%，色盲在男性中的發(fā)病率為７％?，F(xiàn)有一對表現(xiàn)正常的夫婦,妻子為該常染色體遺傳病致病基因和色盲致病基因攜帶者。那么他們所生小孩同時患上述兩種遺傳病的概率是A。1/88B。１/22C5．經調查統(tǒng)計某地區(qū)人群中藍眼(aａ）1600人，純合褐眼（ＡA)1４０0人,雜合褐眼（Aａ）7000人,那么該地區(qū)人群中藍眼基因和褐眼基因的基因頻率分別是-—－———－--－———－—-－－(）Ａ。51％和49％??B．４３％和5７％C．32％和68％? ?D.２8%和７2%6.(2００7年唐山二模)某植物種群,ＡA基因型個體占30%，aa基因型個體占20％，則:(1）植物的A、a基因頻率分別是、。（２）若該植物自交,后代中AA、ａa基因型個體分別占、。這時，A、a的基因頻率分別是。(3）依據(jù)現(xiàn)代生物進化理論，這種植物在兩年中是否發(fā)生了進化？,原因是。（4）由此可知，生物進化的基本單位是,進化的原材料由提供，是否發(fā)生進化決定于，進化的實質是。參考答案:變式訓練:１.A２．C3.B4．A反饋訓練：１。Ｂ2。C３。D4．A5.A6．（1）５5%、45%（2）42.5%32.5%５5％、45％（３)沒有發(fā)生進化基因頻率沒有發(fā)生改變（4）種群突變和基因重組自然選擇種群基因頻率的改變作者簡介：左延柏,男，中學高級教師,中國教育工作者協(xié)會會員，江蘇省南京市高三生物教學研究核心小組成員.地址：江蘇省南京市大橋南路16號郵編：２１０015電話：Emａｉl：zｙb210０15＠16３。coｍ?施工作業(yè)指導書? 差異化分析表施工作業(yè)指導書名稱《一般土石方工程作業(yè)指導書》施工作業(yè)指導書編號TSFGC-01具體內容:適用范圍:一般土石方工程作業(yè)指導書滿足要求.編寫依據(jù):一般土石方工程作業(yè)指導書滿足要求.作業(yè)流程圖:一般土石方工程作業(yè)指導書滿足要求.安全風險辨析與預控:表4.1作業(yè)任務安全基準風險指南中的第12、13、16項與現(xiàn)場實際不符，本工程不需要風鎬機，基坑內無巖石，以及沒有用到打夯機夯實。作業(yè)準備：作業(yè)前施工條件以及人員、主要工具器和儀器儀表配置均與作業(yè)指導書所列相符。作業(yè)方法：一般土石方工程作業(yè)指導書滿足施工要求。質量控制措施及檢驗標準:一般土石方工程作業(yè)指導書滿足要求.?施工作業(yè)指導書? 差異化分析表施工作業(yè)指導書名稱《電纜管道作業(yè)指導書》施工作業(yè)指導書編號DLTJ-02具體內容:適用范圍:作業(yè)指導書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導書滿足施工要求.安全風險辨析與預控:表4.1作業(yè)任務安全基準風險指南中的第10、17項與現(xiàn)場實際不符，本工程不需要風鎬機，起重作業(yè)沒有用到起重機。作業(yè)準備：作業(yè)前施工條件以及人員、主要工具器和儀器儀表配置均與作業(yè)指導書所列相符。作業(yè)方法：本工程作業(yè)方法與作業(yè)指導書中的作業(yè)方法第7項不符，工程沒有采用支撐墩的作業(yè)方法，其他項作業(yè)方法與書中所列一致。質量控制措施及檢驗標準:作業(yè)指導書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導書? 差異化分析表施工作業(yè)指導書名稱《電纜井作業(yè)指導書》施工作業(yè)指導書編號DLTJ-03具體內容:適用范圍:作業(yè)指導書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導書滿足施工要求.安全風險辨析與預控:表4.1作業(yè)任務安全基準風險指南中的第17、20項與現(xiàn)場實際不符，本工程不需要用到砂漿攪拌機以及打夯機。作業(yè)準備：作業(yè)前施工條件以及人員、主要工具器和儀器儀表配置均與作業(yè)指導書所列相符。作業(yè)方法：本工程作業(yè)方法與作業(yè)指導書中的作業(yè)方法第7項不符，工程沒有采用圈梁混凝土澆筑的作業(yè)方法，其他項作業(yè)方法與書中所列一致。質量控制措施及檢驗標準:作業(yè)指導書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導書? 差異化分析表施工作業(yè)指導書名稱《電纜支架作業(yè)指導書》施工作業(yè)指導書編號PWDK-01具體內容:適用范圍:作業(yè)指導書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導書滿足施工要求.安全風險辨析與預控:表4.1作業(yè)任務安全基準風險指南中的第2、3、5項與現(xiàn)場實際不符，本工程為室內電纜溝支架安裝。作業(yè)準備：作業(yè)前施工條件以及人員、主要工具器和儀器儀表配置均與作業(yè)指導書所列相符。作業(yè)方法：作業(yè)指導書滿足施工要求。質量控制措施及檢驗標準:作業(yè)指導書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導書? 差異化分析表施工作業(yè)指導書名稱《電纜敷設作業(yè)指導書》施工作業(yè)指導書編號DLFS-01具體內容:適用范圍:作業(yè)指導書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導書滿足施工要求.安全風險辨析與預控:作業(yè)指導書滿足施工要求。作業(yè)準備：施工現(xiàn)場與作業(yè)指導書中的表5.1中第6項所提電纜橋架內容不適用，表5.2中第3項施工船、牽引機、埋設機、高壓水泵等不適用，其他內容均相符。作業(yè)方法：作業(yè)指導書滿足施工要求。質量控制措施及檢驗標準:作業(yè)指導書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導書? 差異化分析表施工作業(yè)指導書名稱《電力電纜試驗作業(yè)指導書》施工作業(yè)指導書編號DQSY-07具體內容:適用范圍:作業(yè)指導書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導書滿足施工要求.安全風險辨析與預控:作業(yè)指導書滿足施工要求。作業(yè)準備：作業(yè)指導書滿足施工要求。作業(yè)方法：作業(yè)指導書滿足施工要求。質量控制措施及檢驗標準:作業(yè)指導書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導書? 差異化分析表施工作業(yè)指導書名稱《冷縮電纜中間接頭制作安裝作業(yè)指導書》施工作業(yè)指導書編號DLFJAZ-03具體內容:適用范圍:作業(yè)指導書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導書滿足施工要求.安全風險辨析與預控:現(xiàn)場實際與表4.1中第6、7項不符，本工程沒有隧道。作業(yè)準備：作業(yè)指導書滿足施工要求。作業(yè)方法：作業(yè)指導書滿足施工要求。質量控制措施及檢驗標準:作業(yè)指導書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導書? 差異化分析表施工作業(yè)指導書名稱《冷縮電纜終端接頭制作安裝作業(yè)指導書》施工作業(yè)指導書編號DLFJAZ-01具體內容:適用范圍:作業(yè)指導書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導書滿足施工要求.安全風險辨析與預控:作業(yè)指導書滿足施工要求。作業(yè)準備：作業(yè)指導書滿足施工要求。作業(yè)方法：作業(yè)指導書滿足施工要求。質量控制措施及檢驗標準:作業(yè)指導書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導書? 差異化分析表施工作業(yè)指導書名稱《電纜防火封堵作業(yè)指導書》施工作業(yè)指導書編號DLFHFD-01具體內容:適用范圍:作業(yè)指導書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導書滿足施工要求.安全風險辨析與預控:施工現(xiàn)場與表4.1中第1、2項不符，本工程沒有隧道。作業(yè)準備：作業(yè)指導書滿足施工要求。作業(yè)方法：作業(yè)指導書滿足施工要求。質量控制措施及檢驗標準:作業(yè)指導書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導書? 差異化分析表施工作業(yè)指導書名稱《電纜終端頭接地及保護管安裝作業(yè)指導書》施工作業(yè)指導書編號DLFJAZ-05具體內容:適用范圍:作業(yè)指導書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導書滿足施工要求.安全風險辨析與預控:作業(yè)指導書滿足施工要求。作業(yè)準備：作業(yè)指導書滿足施工要求。作業(yè)方法：作業(yè)指導書滿足施工要求。質量控制措施及檢驗標準:作業(yè)指導書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導書? 差異化分析表施工作業(yè)指導書名稱《戶外隔離開關安裝作業(yè)指導書》施工作業(yè)指導書編號HWDQSB-02具體內容:適用范圍:作業(yè)指導書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導書滿足施工要求.安全風險辨析與預控:作業(yè)指導書滿足施工要求。作業(yè)準備：作業(yè)指導書滿足施工要求。作業(yè)方法：作業(yè)指導書滿足施工要求。質量控制措施及檢驗標準:作業(yè)指導書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導書? 差異化分析表施工作業(yè)指導書名稱《接地工程作業(yè)指導書》施工作業(yè)指導書編號JDGC-01具體內容:適用范圍:作業(yè)指導書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導書