流式細(xì)胞術(shù)原理及應(yīng)用新

流式細(xì)胞術(shù)原理及應(yīng)用新第一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日FLOWCYTOMETRY

流式細(xì)胞術(shù)FLOWCYTOMETOR流式細(xì)胞儀第三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日FlowCytometryMeasuringpropertiesofcellsinflowFlowSortingSorting(separating)cellsbasedonpropertiesmeasuredinflowAlsocalledFluorescence-ActivatedCellSorting(FACS)第四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日分為三大類：第一類－－臺(tái)式機(jī)

光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定，自動(dòng)化程度高，操作簡便，易學(xué)易掌握,適合用于臨床第二類－－大型機(jī)

科研型，分辨率高，可分選用于培養(yǎng)，可選配多種激光器，更靈活第三類－－新型流式細(xì)胞儀

裝配有2～4根激光管，同時(shí)檢測15個(gè)參數(shù)，高速分選達(dá)50000個(gè)/s第五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日流式細(xì)胞儀的主要組成部分：光路系統(tǒng)鞘液系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)換及放大系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日流式細(xì)胞術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種技術(shù)，有人將流式細(xì)胞儀比喻成高級的熒光顯微鏡。目前，該技術(shù)以廣泛用于生物及醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究與臨床檢測，在分子生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域內(nèi)發(fā)揮著重要作用。第十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日

流式細(xì)胞儀熒光顯微鏡控制電腦人腦光源激光紫外光標(biāo)本制備成的單細(xì)胞（或顆粒）懸液放于固定的標(biāo)本臺(tái)上效率高幾百~幾萬個(gè)細(xì)胞/秒低幾十個(gè)細(xì)胞/分結(jié)果精確、客觀有主觀因素功能可同時(shí)測多個(gè)參數(shù)、能進(jìn)行分選一般只測一個(gè)參數(shù)、不能分選第十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日鞘液系統(tǒng)流動(dòng)室第十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日光路系統(tǒng)檢測區(qū)第十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第二十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日光學(xué)原理laser第二十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第二十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第二十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第二十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日抗體標(biāo)記的方法第二十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日抗體的選擇首選直接標(biāo)記抗體熒光分子

PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原

FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原間接標(biāo)記

適用范圍廣,biotin-avidin不適合弱抗原的檢測第二十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第二十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日流式細(xì)胞分析的信息Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)FL1-FITCFL2-PEFL3-PerCPPL4-APC第二十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日流式細(xì)胞的基本信息:“形態(tài)”第二十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日流式細(xì)胞的主要信息:FluorescenceFL1FL2FL3FL4最常用的標(biāo)記方法是熒光素分子標(biāo)記的抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合第三十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日Gating

常用術(shù)語第三十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日流式常見圖形

(Histogram

Plot)直方圖適用于：單參數(shù)分析第三十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日流式常見圖形

(DotPlot)散點(diǎn)圖適用于：多參數(shù)分析第三十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日流式應(yīng)用常見范圍細(xì)胞大小細(xì)胞的顆粒度細(xì)胞表面分子：CD系列細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞核內(nèi)分子：P53細(xì)胞功能檢測：細(xì)胞周期、凋亡其他（膜電位、鈣離子濃度、核酸等）第三十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日實(shí)驗(yàn)對照的設(shè)計(jì)空白對照：ALL陰性對照：常用同型抗體對照單色分析：設(shè)同型抗體對照多色分析：同型對照，單陽性對照

（用于儀器校正）陽性對照：檢測陰性時(shí)第三十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理單細(xì)胞懸液的制備：

物理法（剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨粉）

化學(xué)法（酶消化）抗體或標(biāo)記分子的染色：抗原抗體反應(yīng)非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉

封閉－－血清和同型抗體第三十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日可用流式細(xì)胞儀分析的標(biāo)本外周血、骨髓、癌組織、癌旁組織、石蠟切片、各種體液（尿、腦脊液、胸腹水等）

必需制備成單細(xì)胞懸液單細(xì)胞生物、特殊處理的植物細(xì)胞、某些非細(xì)胞粒子、可溶性分子第三十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日

待測標(biāo)本處理成單event懸液熒光素標(biāo)記的單抗染色鞘液經(jīng)處理的細(xì)胞單個(gè)通過激光聚焦區(qū)檢測散射光、熒光

信號轉(zhuǎn)化、放大

計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理分選第三十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日SORTING（細(xì)胞分選）分選速度分選純度分選收獲率第三十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第四十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用

細(xì)胞死亡分兩種：凋亡和壞死細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過程，而是主動(dòng)過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用；它并不是病理?xiàng)l件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭取的一種死亡過程。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，就像樹葉或花的自然凋落一樣，借用希臘“Apoptosis”來表示，意思是像樹葉或花的自然凋落，可譯為細(xì)胞凋亡。

（一）凋亡的檢測第四十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別

雖然凋亡與壞死的最終結(jié)果極為相似，但它們的過程與表現(xiàn)卻有很大差別。

壞死（necrosis）：壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細(xì)胞脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。

凋亡是細(xì)胞對環(huán)境的生理性、病理性刺激信號，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過程。其細(xì)胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。

第四十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義胚胎形成、肌體正常發(fā)育、衰老和損傷細(xì)胞的清除以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸等都與細(xì)胞凋亡有關(guān)。生物醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)第四十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日凋亡檢測

每一步都有檢測試劑盒每一步都有檢測試劑盒第四十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日1、半胱氨酸蛋白酶3檢測法（早早期）2、AnnexinV-FITC/PI法（早期）3、Apo2.7檢測法（早期）4、TUNEL法（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚期）6、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的流式細(xì)胞術(shù)檢測流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡第四十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日

亞二倍體峰（凋亡峰）

---PIstaining

不能區(qū)分凋亡與死亡細(xì)胞第四十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日AnnexinVAssay

建議用于懸浮細(xì)胞第四十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日AnnexinVAssay

能夠區(qū)分死亡與凋亡

第四十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第四十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日細(xì)胞周期G1MG2SQuiescentcellsG0第五十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日（二）定量流式細(xì)胞術(shù)（quantitativeflowcytomety)

通過檢測標(biāo)準(zhǔn)微球的熒光強(qiáng)度獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求得待測細(xì)胞的某種生物分子的精確數(shù)值，從而反映在某種生理病理?xiàng)l件下出現(xiàn)的微細(xì)變化，對臨床疾病的研究、診斷及治療等具有重要意義。第五十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日微球流式芯片技術(shù)

CBA(CytometricBeadArray)采用夾心法分析策略,以微珠來捕獲可溶性分子。第五十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日（三）流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用白血病免疫分型HLA-B27:強(qiáng)直性脊柱炎淋巴細(xì)胞亞群造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)：造血干細(xì)胞移植網(wǎng)織紅細(xì)胞PNH診斷（CD55、CD59）血小板活化試驗(yàn)第五十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日流式細(xì)胞術(shù)與造血干細(xì)胞移植第五十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日流式細(xì)胞術(shù)與白血病免疫分型第五十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日流式細(xì)胞的免疫分型：是白血病分型的重要指標(biāo)，而白血病分類是選擇化療方案和判斷預(yù)后的重要依據(jù)。

FAB標(biāo)準(zhǔn)(MICM)，形態(tài)學(xué)、免疫表型染色體、分子生物學(xué)結(jié)合,適合于白血病的分型診斷，但不適合用于確診是不是白血病。Minimalresidualdiseases(MRD)第五十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日微小殘留病變的檢出（MRD）：

MRD是白血病復(fù)發(fā)的主要根源，F(xiàn)CM的高特異性和敏感性可以在患者緩解期檢測是否有殘留病變細(xì)胞，早期探測MRD，以免復(fù)發(fā)。第五十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日有證據(jù)表明外周血淋巴細(xì)胞HLA-B27的表達(dá)及其表達(dá)程度與強(qiáng)直性脊髓炎的發(fā)生有很大相關(guān)性，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行HLA-B27檢測，可同時(shí)排除交叉反應(yīng)，是目前檢測HLA-B27的最好方法。流式細(xì)胞術(shù)與強(qiáng)直性脊柱炎第五十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第五十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日淋巴細(xì)胞亞群分析

機(jī)體免疫狀態(tài)是衡量機(jī)體是否罹患疾病的重要指標(biāo)，目前多采用流式細(xì)胞術(shù)來檢測機(jī)體的免疫狀態(tài)，其中最重要的指標(biāo)是檢測T,B,NK淋巴細(xì)胞的水平。第六十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日常用細(xì)胞表型及意義（clusterofdifferentiation,CD)CD3總T細(xì)胞CD4T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞亞群CD8T抑制/細(xì)胞毒細(xì)胞亞群CD19B細(xì)胞抗原CD16+56NK細(xì)胞CD33髓細(xì)胞前體CD34多能干細(xì)胞第六十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日由于T淋巴細(xì)胞在人體的免系統(tǒng)中承擔(dān)著重要功能，因此當(dāng)感染發(fā)生時(shí)，T淋巴細(xì)胞各亞群的變化往往能很敏感地反應(yīng)感染的狀態(tài)和程度。例如：CD4分子有HIV識別部位，因CD4細(xì)胞是HIV病毒的受體，AIDS患者CD4+T細(xì)胞明顯減少，該指標(biāo)是診斷AIDS的重要指標(biāo)。當(dāng)病毒感染發(fā)生時(shí)（如乙型肝炎、EB病毒和巨細(xì)胞病毒包涵體病毒），CD8+T細(xì)胞增多，對CD8T細(xì)胞測定有助于對感染的診斷、治療效果的動(dòng)態(tài)觀察。第六十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日利用流式細(xì)胞儀可對器官移植和骨髓移植后的患者進(jìn)行監(jiān)控。當(dāng)患者CD3+、CD25+持續(xù)增加提示已開始發(fā)生排異，CD4+/CD8+

T持續(xù)下降，表明有感染發(fā)生，當(dāng)其比值小于0.2時(shí)必需停用免疫抑制劑。

流式細(xì)胞術(shù)與移植第六十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日其它免疫性疾病分析

SLE患者的淋巴細(xì)胞變化可以反應(yīng)該病的活動(dòng)情況和器官侵犯程度，活動(dòng)或非活動(dòng)性伴有多系統(tǒng)疾病，但無腎臟損害的患者可出現(xiàn)CD4+CD8+T比值升高，伴有嚴(yán)重腎臟損害的SLE患者可出現(xiàn)低CD4+、高CD8+的現(xiàn)象。第六十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日流式細(xì)胞術(shù)與PNH利用流式細(xì)胞術(shù)檢測陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（PNH），根據(jù)血細(xì)胞的細(xì)胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂（GPI）所連接的蛋白，如DAF（CD55）與MIRI（CD59），來確診此病，比傳統(tǒng)的血清溶血試驗(yàn)具有更高的特異性與敏感性。第六十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第六十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第六十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日血小板：巨血小板血小板無力癥

網(wǎng)織血小板流式細(xì)胞術(shù)與血小板第六十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日血栓性疾與血栓前狀態(tài)：

由于活化血小板是血栓的主要成分之一，也是引起血栓形成的主要原因，所以血小板活化程度的增高與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。第六十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日流式細(xì)胞術(shù)與網(wǎng)織紅細(xì)胞第七十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日

DNA非整倍體的出現(xiàn)可能是惡變細(xì)胞的重要標(biāo)志，F(xiàn)CM在腫瘤學(xué)上的應(yīng)用，主要是利用DNA含量測定，進(jìn)行癌前病變及早期癌變的檢出、化療指導(dǎo)以及預(yù)后評估等工作。

癌前病變的癌變率與病變的增生程度一致，而增生程度與DNA含量的異常改變又呈平行關(guān)系。

流式細(xì)胞術(shù)與腫瘤第七十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日

FCM通過精確定量DNA含量，能對癌前病變的性質(zhì)和發(fā)展趨勢作出判斷，有助于癌前病變的早期診斷。

DNA倍體分析有助于臨界性腫瘤的診斷，如卵巢交界性腫瘤，異倍體的出現(xiàn)與病變的惡性發(fā)展有關(guān)。第七十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日

DNA異倍體、