免疫學(xué)技術(shù)(第九講)

免疫學(xué)技術(shù)：利用抗原、抗體特異性反應(yīng)的原理建立的各種檢測與分析技術(shù)，以及建立在這些技術(shù)之上的各種制備方法。一般將涉及到抗原、抗體、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子等相關(guān)技術(shù)都稱為免疫技術(shù)。當(dāng)前第1頁\共有32頁\編于星期五\2點分類1、免疫血清學(xué)技術(shù)2、細(xì)胞免疫技術(shù)3、免疫制備技術(shù)4、分子免疫學(xué)技術(shù)當(dāng)前第2頁\共有32頁\編于星期五\2點免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用1、疾病診斷。2、生物活性物質(zhì)的超微定量。3、物種鑒定（血清型、亞型分析等）。4、微生物檢測。5、開發(fā)研制免疫增強藥物、飼料添加劑、疫苗等。6、分子生物學(xué)領(lǐng)域。當(dāng)前第3頁\共有32頁\編于星期五\2點主要內(nèi)容一免疫血清學(xué)技術(shù)二主要血清學(xué)技術(shù)三細(xì)胞免疫技術(shù)四主要細(xì)胞免疫技術(shù)專題一：免疫血清學(xué)技術(shù)當(dāng)前第4頁\共有32頁\編于星期五\2點一、免疫血清學(xué)技術(shù)1、血清學(xué)技術(shù)：簡單地說指體外的抗原與抗體反應(yīng)，由于抗體多來自于血清故稱血清學(xué)。2、分類：（1）凝聚性反應(yīng)：凝集反應(yīng)；沉淀反應(yīng)（2）標(biāo)記抗體技術(shù)：熒光抗體，本酶標(biāo)抗體，放射性標(biāo)記抗體（3）補體參與的反應(yīng)：補體結(jié)合反應(yīng)；（4）中和反應(yīng)：病毒中和試驗（5）免疫轉(zhuǎn)?。篧estenBlotting當(dāng)前第5頁\共有32頁\編于星期五\2點一、免疫血清學(xué)技術(shù)3、特點：（1）特異性和交叉性如豬瘟病毒抗體只能與豬瘟病毒結(jié)合，說明具有特異性；牛痘病毒來預(yù)防人的天花和豬瘟疫苗預(yù)防牛的病毒性腹瀉病的例子說明具有交叉性。當(dāng)前第6頁\共有32頁\編于星期五\2點一、免疫血清學(xué)技術(shù)3、特點：（2）最適比和帶現(xiàn)象帶現(xiàn)象指因抗原或抗體過多而出現(xiàn)的抑制可見反應(yīng)的現(xiàn)象，抗體過多易出現(xiàn)前帶反應(yīng)；抗原過多易出現(xiàn)后帶現(xiàn)象。當(dāng)前第7頁\共有32頁\編于星期五\2點一、免疫血清學(xué)技術(shù)3、特點：（3）反應(yīng)的兩階段性第一階段為抗原與抗體的特異性結(jié)合，反應(yīng)快，幾秒鐘至幾分鐘；第二階段為抗原與抗體的可見現(xiàn)象階段。當(dāng)前第8頁\共有32頁\編于星期五\2點一、免疫血清學(xué)技術(shù)3、特點：（4）反應(yīng)的可逆性抗原與抗以弱的非共價鍵結(jié)合，受物理化學(xué)熱力學(xué)法則制約。在0-40度內(nèi)，PH4-9范圍易結(jié)合；如果溫度超過60度或PH降至3度以下，抗原抗體復(fù)合物又可重新解離。當(dāng)前第9頁\共有32頁\編于星期五\2點一、免疫血清學(xué)技術(shù)3、特點：（5）反應(yīng)的敏感性可用于定性，還可以檢測極微量的抗原或抗體，其靈敏度大超過了常規(guī)的化學(xué)方法。當(dāng)前第10頁\共有32頁\編于星期五\2點一、免疫血清學(xué)技術(shù)4、影響血清學(xué)反應(yīng)的因素電解質(zhì)：一般用NaCl作稀釋液；標(biāo)記抗體常用PBS磷酸鹽緩沖溶液。溫度：一般較高溫度可增加抗原與抗接觸的機會，超過60度易解離。酸堿度：PH6-8較合適。當(dāng)前第11頁\共有32頁\編于星期五\2點二、主要血清學(xué)技術(shù)（一）凝集反應(yīng)1、概念：顆粒性抗原（如細(xì)菌、紅細(xì)胞）與相應(yīng)抗體，在電解質(zhì)存在下，發(fā)生凝集的反應(yīng)。2、分類：直接凝集反應(yīng)、間接凝集反應(yīng)、反向間接凝集反應(yīng)、協(xié)同凝集反應(yīng)等。3、用途：如血型鑒定、牛布病檢測、雞白痢診斷等。當(dāng)前第12頁\共有32頁\編于星期五\2點當(dāng)前第13頁\共有32頁\編于星期五\2點二、主要血清學(xué)技術(shù)（二）沉淀反應(yīng)1、概念：可溶性抗原（細(xì)菌外毒素、內(nèi)毒素，菌體、裂解液、血清、組織浸出液）與相應(yīng)抗體，在電解質(zhì)存在下，發(fā)生凝集的反應(yīng)。2、分類：單向瓊脂擴散、雙向瓊脂擴散、對流免疫電泳、火箭電泳等。3、用途：如炭疽、小鵝瘟診斷等。當(dāng)前第14頁\共有32頁\編于星期五\2點AscoliAgAb對流免疫電泳當(dāng)前第15頁\共有32頁\編于星期五\2點當(dāng)前第16頁\共有32頁\編于星期五\2點二、主要血清學(xué)技術(shù)（三）免疫標(biāo)記技術(shù)1、概述：抗原與抗體能特異性結(jié)合，但抗體抗原分子小，含量低時，形成的復(fù)合物是不可見的。如果將超微量的物質(zhì)標(biāo)記（熒光素、酶、放射性同位素）就可檢測出微量的抗原與抗體復(fù)合物，其特異性與敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過常規(guī)血清學(xué)方法，被廣泛用于病原微生物鑒定，傳染病診斷及基因表達(dá)產(chǎn)物分析等。當(dāng)前第17頁\共有32頁\編于星期五\2點二、主要血清學(xué)技術(shù)（三）免疫標(biāo)記技術(shù)2、分類：（1）免疫熒光技術(shù)（2）免疫酶技術(shù)（3）放射免疫測定法（4）免疫印跡法（5）免疫金標(biāo)技術(shù)（6）免疫PCR當(dāng)前第18頁\共有32頁\編于星期五\2點當(dāng)前第19頁\共有32頁\編于星期五\2點小鼠脾臟免疫熒光圖像當(dāng)前第20頁\共有32頁\編于星期五\2點免疫酶技術(shù)當(dāng)前第21頁\共有32頁\編于星期五\2點3、免疫酶技術(shù)（1）原理：通過化學(xué)方法將酶與抗體或抗抗體結(jié)合，形成酶標(biāo)記物，這些酶標(biāo)記物仍保持免疫學(xué)活性和酶的活性，然后將它與相應(yīng)的抗體或抗原起反應(yīng)，形成酶標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物，結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶在遇到相應(yīng)的底物時，而顯色。當(dāng)前第22頁\共有32頁\編于星期五\2點3、免疫酶技術(shù)（2）分類：免疫酶組化法免疫酶測定法酶標(biāo)記抗體法抗酶抗體法液相測定法固相測定法間接法雙抗體夾心法競爭法免疫酶技術(shù)當(dāng)前第23頁\共有32頁\編于星期五\2點3、免疫酶技術(shù)（3）特點：靈敏度高，檢測能力可達(dá)毫微克水平。應(yīng)用范圍廣，既能測抗體又能檢測抗原，既能定性又能定量、定位及抗原分析。標(biāo)本可長期保存。酶標(biāo)記物有效時間較長，一般低溫保存可達(dá)一年以上。不需要特殊設(shè)備。當(dāng)前第24頁\共有32頁\編于星期五\2點（4）操作過程：當(dāng)前第25頁\共有32頁\編于星期五\2點二、主要血清學(xué)技術(shù)（四）補體結(jié)合技術(shù)當(dāng)前第26頁\共有32頁\編于星期五\2點專題二：細(xì)胞免疫技術(shù)1、概述：細(xì)胞免疫檢測主要包括T細(xì)胞及亞群的計數(shù)、T細(xì)胞活性測定、各種淋巴因子的檢測、K細(xì)胞、NK細(xì)胞活性試驗，以及皮膚過敏試驗等。2、用途：（1）測定疾病個體的細(xì)胞免疫狀態(tài)及水平；（2）篩選免疫增強劑或免疫抑制藥物；（3）測定淋巴因子活性等當(dāng)前第27頁\共有32頁\編于星期五\2點細(xì)胞免疫技術(shù)3、分類：E花環(huán)試驗淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗白細(xì)胞移動抑制試驗白細(xì)胞介素測定酸性α醋酸萘酯酶測定當(dāng)前第28頁\共有32頁\編于星期五\2點主要細(xì)胞免疫技術(shù)（一）E玫瑰花環(huán)試驗1、原理：人、豬、牛、羊等的T細(xì)胞膜上的CD2是綿羊紅細(xì)胞受體，馬、豬的T細(xì)胞膜上的CD2是豚鼠紅細(xì)胞的受體。2、用途：區(qū)分T淋巴細(xì)胞當(dāng)前第29頁\共有32頁\編于星期五\2點主要細(xì)胞免疫技術(shù)（二）淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗1、原理：PHA+T細(xì)胞（有PHA受體）轉(zhuǎn)化大的淋巴母細(xì)胞

顯微鏡觀察計算轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率=(過渡型細(xì)胞+母細(xì)胞)/200個淋巴細(xì)胞×100%2、用途：淋巴細(xì)胞計數(shù)，監(jiān)測免疫機能3、特點：簡便、準(zhǔn)確性差形態(tài)學(xué)法當(dāng)前第30頁\共有32頁\編于星期五\2點當(dāng)前第31頁\共有32頁\編于星期五\2點3H胸腺嘧啶核苷（3H-T）摻入法原理：試驗管對照管PHA+T細(xì)胞+3H-TdRPHA+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞淋