目的基因的功能驗(yàn)證

目的基因的功能驗(yàn)證減弱該基因在細(xì)胞內(nèi)的作用基因敲除RNAi增強(qiáng)該基因在細(xì)胞中的作用基因的過(guò)量表達(dá)2021/5/91基于同源重組的方法2021/5/92針對(duì)單細(xì)胞微生物小鼠2021/5/93正負(fù)雙向篩選法正選擇標(biāo)記抗生素抗性基因負(fù)選擇標(biāo)記致死基因tk將無(wú)毒的核酸類似物（GANC）轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘晕镔|(zhì)2021/5/94完全基因敲除的弊端基因完全失活，對(duì)于看家基因來(lái)說(shuō)，該基因缺失的突變往往具有致死效應(yīng)，突變體不易存活改進(jìn)：條件基因敲除，實(shí)現(xiàn)基因敲除在空間和時(shí)間上的可控性2021/5/95空間上的可控（組織特異性敲除）loxP位點(diǎn)：一段34堿基的特定DNA序列，具有方向性Cre重組酶：介導(dǎo)loxP位點(diǎn)發(fā)生重組的酶2021/5/96Cre-LoxP系統(tǒng)的基因敲除2021/5/97構(gòu)建條件基因打靶小鼠：將靶基因兩端錨定上同向的LoxP位點(diǎn)構(gòu)建組織特異性Cre轉(zhuǎn)基因鼠將上述兩小鼠雜交，得到組織特異性基因敲除小鼠2021/5/98時(shí)間上的可控性用可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子調(diào)控Cre重組酶的表達(dá)加入誘導(dǎo)物之后，啟動(dòng)子才具有活性2021/5/99針對(duì)DNA上的靶位點(diǎn)，根據(jù)其兩側(cè)序列設(shè)計(jì)兩個(gè)鋅指蛋白分子

2021/5/910CRISPR-Cas9在CRISPR/Cas系統(tǒng)里，短片段的外源DNA分子轉(zhuǎn)錄為crRNA,與tracrRNA結(jié)合，介導(dǎo)了序列特異性的切割作用，最后在Cas蛋白的作用下使靶標(biāo)基因發(fā)生突變2021/5/911反義RNA是指與mRNA互補(bǔ)的RNA分子，可直接與mRNA形成雙鏈RNA。由于核糖體不能翻譯雙鏈RNA，所以反義RNA可抑制該mRNA的翻譯。2021/5/912如何操作？？1.向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化雙鏈RNA分子（轉(zhuǎn)化上的難度，不能穩(wěn)定遺傳）2.向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化DNA分子，轉(zhuǎn)錄后成為雙鏈RNA3.將2個(gè)DNA分子（分別編碼靶基因的正義鏈和反義鏈），分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞4.較繁瑣，如何只通過(guò)轉(zhuǎn)化1個(gè)DNA分子，就能實(shí)現(xiàn)RNAi？2021/5/913基因的過(guò)量表達(dá)（overexpression）通過(guò)強(qiáng)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)，使某一功能基因高于正常生理水平表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)基因過(guò)表達(dá)后對(duì)某一性狀和表型造成的影響，來(lái)推測(cè)基因的功能。單細(xì)胞多細(xì)胞在特定組織中的定時(shí)表達(dá)2021