大黃酸抑制線粒體分裂和EMT減緩乳腺癌細(xì)胞遷移

大黃酸抑制線粒體分裂和EMT減緩乳腺癌細(xì)胞遷移**［基金項(xiàng)目］國(guó)家留學(xué)基金委資助項(xiàng)目（201808525116），西部地區(qū)人才培養(yǎng)特別項(xiàng)目，受助人：李小波；遵義醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金（F-885）:大黃酸對(duì)乳腺癌前病變線粒體分裂-融合動(dòng)力學(xué)失衡的機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：李小波。［通訊作者］鄭衍芳,女，博士，講師，研究方向：中藥防治乳腺癌，E-mail:158609027@。李小波1，謝艷2，陳金霞2，婁興鳳2，苗春龍2，范慶范慶3，鄭衍芳4收稿日期：2022-08-09修回日期：收稿日期：2022-08-09修回日期：2022-10-28基金項(xiàng)目：國(guó)家留學(xué)基金管理委員會(huì)西部地區(qū)人才培養(yǎng)特別項(xiàng)目（201808525116）：西部地區(qū)人才培養(yǎng)特別項(xiàng)目，負(fù)責(zé)人：李小波；遵義醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金（F-885）：大黃酸對(duì)乳腺癌前病變線粒體分裂-融合動(dòng)力學(xué)失衡的機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：李小波。通訊作者：鄭衍芳，女，博士，講師，主要研究方向：中藥防治乳腺癌。(（1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)1診斷學(xué)教研室，廣東珠海519000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)生物工程系，廣東珠海519000；3數(shù)理教研室，.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)數(shù)理教研室廣東珠海519000；4.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)生理學(xué)教研室，廣東珠海519000)）［摘要］：目的探討大黃酸對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的線粒體分裂和上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）的影響。方法乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231分為對(duì)照組(（0μmol/·L-1大黃酸組)）、低劑量大黃酸組(（100μmol/·L-1大黃酸組)）、高劑量大黃酸組(（200μmol/·L-1大黃酸組),），不同濃度大黃酸處理24小時(shí)后h后，采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況，透射電鏡檢測(cè)線粒體形態(tài)和分布，免疫印跡法檢測(cè)線粒體融合蛋白2（Mitofusi2，Mfn2）和動(dòng)力相關(guān)蛋白1（Dynamin-relatedprotein1,，Drp1）、波形蛋白（Vimentin）、E鈣粘蛋白（E-cadherin）蛋白的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，大黃酸可減低Drp1、Vimentin蛋白表達(dá)（P<<0.05），增高M(jìn)fn2、E-cadherin蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞線粒體數(shù)目和上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的情況，從而減低乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231轉(zhuǎn)移（P<<0.05）。大黃酸高劑量效果較低劑量更佳（P<<0.05）。結(jié)論大黃酸通過降低Drp1，Vimentin，增高M(jìn)fn2，E-cadherin蛋白表達(dá)，降低線粒體分裂和上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，抑制乳腺癌遷移。[關(guān)鍵詞]：大黃酸；乳腺癌轉(zhuǎn)移；線粒體分裂；上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中圖分類號(hào)：R285.5SilibininattenuatesmigrationAttenuatesMigrationofbreastcancerBreastCancerMDA‐MB‐231cellsthroughinhibitingmitochondrialfissionCellsThroughInhibitingMitochondrialFissionandEMTLiXiaobo1,XieYan2,ChenJinxia2,LouXingfeng2,MiaoChunlong2,LouXingfeng2,FanQing3,ZhengYanfang4(1Department（1.DepartmentofDiagnosis,2DepartmentZhuhaiCampusofZunyiMedicalUniversity,Zhuhai519000,China;2.DepartmentofBioengineering,3DepartmentZhuhaiCampusofZunyiMedicalUniversity,Zhuhai519000,China;3.DepartmentofMathematicsandPhysics,4DepartmentZhuhaiCampusofZunyiMedicalUniversity,Zhuhai519000,China;4.DepartmentofPhysiology,ZhuhaicampusCampusofZunyiMedicalUniversity,ZhuhaiGuangdong519000,China)）[Abstract]:ObjectiveToinvestigatetheeffectsoftherheinonthemitochondriafissionandepithelial-mesenchymaltransition(EMT)ofbreastcancercellsMDA-MB-231.MethodsHumanbreastcancercellswereintervenedwithrhein,andthecellsweredividedintocontrolgroup(0μmol/·L),-1),lowdoserheingroup(100μmol/·L-1),andhighdoserheingroup(200μmol/·L).-1).TheproliferationactivityofthecellswasdetectedbyCCK-8,andmigrationswasdetectedbyScratch‐healingmigrationassay.Themorphologyanddistributionofmitochondriaweredetectedbytransmissionelectronmicroscope,andtheexpressionlevelsofDynamin-relatedprotein1(Drp1),mitofusin2(Mfn2),E-cadherin,VimentinproteinsweredetectedbyWesternblot.ResultsComparedwithcontrolgroup,RheinsignificantlyreducedtheproteinexpressionofDrp1、Vimentin(P<<0.05),andincreasedE-cadherinandMfn2,thusdown-regulatingmitochondriafission,inhibitingcellproliferationandmigration.HighdoseRheinwasbetterthanlowdose.ConclusionRheincaninhibittheproliferationandmigrationofbreastcancercellsbyreducingtheexpressionofDrp1、,Vimentinandup-regulatingMfn2,E-cadherinproteins.[Keywords]Keywords:Rhein;breast,Breastcancer;,Mitochondriafission;,EMT2020年全球乳腺癌（breastBreastcancer,，BC）新發(fā)病例高達(dá)226萬例，超過了肺癌的220萬例，成為全球第一大癌[1]。乳腺癌是全世界女性中最常見的癌癥，在我國(guó)女性乳腺癌的發(fā)病率逐年增高，其發(fā)病率為居位居女性腫瘤的第1位，每年有超過30萬的新發(fā)患者，其死亡率為女性腫瘤第4位[2,-3]。約90%以上的癌癥相關(guān)死亡是由轉(zhuǎn)移引起的。診斷為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中僅有27%存活5年。因此，抑制癌癥轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)因素至關(guān)重要，對(duì)提高生存率有重大意義。癌癥轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的過程，涉及腫瘤與微環(huán)境之間的相互作用。轉(zhuǎn)移進(jìn)展的初始步驟是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有遷移和侵襲細(xì)胞的特征，稱為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialEpithelial-mesenchymaltransition，EMT）。線粒體是細(xì)胞的能量工廠，產(chǎn)生ATP供能。線粒體在細(xì)胞骨架上不斷融合、分裂和移動(dòng)，形成線粒體網(wǎng)絡(luò)。融合由有絲分裂融合蛋白1（Mitofusi1，Mfn1）、有絲分裂融合蛋白2（Mitofusi2，Mfn2）等催化，而分裂由動(dòng)力相關(guān)蛋白（Dynamin-relatedprotein1，Drp1）和線粒體分裂蛋白1（mitochondrialMitochondrialfissionprotein1，F(xiàn)is1）等調(diào)控[4-6]。線粒體分裂可以促進(jìn)EMT，研究表明線粒體分裂形成片段，以便在細(xì)胞前沿運(yùn)輸和積累，產(chǎn)生更多的ATP，促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移[7]。與乳腺細(xì)胞MCF-10A相比，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231高表達(dá)DRP1，低表達(dá)Mfn2[8]。三陰性乳腺癌細(xì)胞相較低轉(zhuǎn)移性的非三陰性乳腺癌細(xì)胞Drp1升高更明顯。敲除Drp1可抑制乳腺癌細(xì)胞遷移，同時(shí)敲除MFN2/1減緩這種作用[9]。大黃酸（Rhein）化學(xué)名為4，,5-二羥基2-羧酸蒽醌，屬單蒽核類1，,8-二羥基蒽醌衍生物，主要分布于中藥大黃、何首烏等?，F(xiàn)代研究表明，大黃酸可通過影響Stat/Snail、PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[10,-11]。大黃酸可導(dǎo)致線粒體膜電位升高，產(chǎn)生更多的ROS，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[12]。然而，目前尚不明確大黃酸是否通過影響線粒體動(dòng)力學(xué)失調(diào)和EMT，從而抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。本研究使用MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，檢測(cè)大黃酸是否通過調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)和EMT，從而減緩癌細(xì)胞遷移。探索大黃酸對(duì)乳腺癌的作用機(jī)制，提高大黃酸對(duì)乳腺癌的應(yīng)用開發(fā)前景。1材料與方法1.1材料1.1.1細(xì)胞株來源人乳腺癌癌細(xì)胞MDA-MB-231（貨號(hào):：HYC3553）購(gòu)自和元生物技術(shù)有限公司。1.1.2藥物和試劑BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：P0010）購(gòu)自中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗：Mfn2（批號(hào)：PB0264）；Vimentin（批號(hào)：PB9359）；E-cadherin（批號(hào)：BA0475）、β-actin（批號(hào)：BM0627）、羊抗兔IgG(（HRP)）二抗(（批號(hào)：BA1054)）購(gòu)自武漢博士德公司。Drp1（批號(hào)：ab56788）購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。大黃酸（批號(hào)：DD002901，HPLC≥≥98%）購(gòu)自成都德思特公司，CCK-8試劑盒(（貨號(hào):：K0301)）購(gòu)自MedChemExpress公司。1.1.3儀器SW-CJ-2F潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；HF90型CO2CO2培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；3K15型高速冷凍離心機(jī)（湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；M502868型多功能酶標(biāo)儀（廣東省農(nóng)墾集團(tuán)進(jìn)出口有限公司有限公）；IX71型熒光倒置顯微鏡（日本奧林巴斯）；Mini-PROTEAN蛋白電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；HT7700透射電子顯微鏡（日本日立公司）。1.2方法1.2.1CCK8實(shí)驗(yàn)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞細(xì)胞接種于96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔。加入不同濃度梯度的大黃酸繼續(xù)培養(yǎng)24h24h后，每孔避光加10μLCCK8LCCK8溶液，37°C中繼續(xù)培養(yǎng)2h2h。酶標(biāo)儀下檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm490nm處的吸光度(（A)）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇效果明顯的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.2.2克隆形成實(shí)驗(yàn)取700個(gè)cells/孔接種于6孔板，保證每個(gè)細(xì)胞均分散成單個(gè)細(xì)胞，分別加入100μmol/·L、200-1、200μmol/·L-1的大黃酸，并設(shè)置0μmol/·L-1大黃酸為對(duì)照組，連續(xù)培養(yǎng)7天。PBS輕洗兩次，每孔加入1ml1mL的4%多聚甲醛，室溫固定30min30min。用0.1%結(jié)晶紫染色10min10min，棄掉染液，用ddH2O清洗2~-3次，晾干后觀察克隆數(shù)，拍照并統(tǒng)計(jì)克隆形成數(shù)。克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)6孔板底部外側(cè)用黑色標(biāo)記筆均勻劃三條橫線，將每孔三等分。待細(xì)胞密度大約為90%時(shí)，用200μL槍頭輕輕均勻劃豎線劃痕，使其與標(biāo)記的橫線垂直。PBS洗兩2遍去除懸浮的細(xì)胞后在倒置顯微鏡下拍攝此時(shí)劃痕寬度，記為0h0h。重新加入100μmol/·L、200-1、200μmol·L-1的大黃酸，并設(shè)置0μmol/·L-1大黃酸為對(duì)照組，繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在加藥24時(shí)h記錄細(xì)胞劃痕寬度變化。1.2.4透射電鏡觀察線粒體形態(tài)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至6孔板，培養(yǎng)24h后添加200μmol/·L-1大黃酸處理24h24h，并設(shè)置0μmol/·L-1大黃酸為對(duì)照組，培養(yǎng)24h24h后棄去培養(yǎng)液，加入電鏡固定液4℃固定4h,4h，細(xì)胞低速離心提取細(xì)胞，1%瓊脂糖包裹，1%的鋨酸·0.1M1mol·L-1磷酸緩沖液PB固定2h2h。梯度乙醇脫水、滲透、包埋。切80nm80nm超薄切片，鈾鉛雙染色，切片室溫干燥過夜。透射電子顯微鏡下觀察拍片。1.2.5免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至6孔板，培養(yǎng)24h后，加入100μmol/·L-1、200μmol/·L-1大黃酸處理24h24h，并設(shè)置0μmol/·L-1大黃酸為對(duì)照組，培養(yǎng)完成后PBS緩沖液清洗2次，加入適量RIPA裂解液，離心10分鐘min，取上清，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加20μL蛋白上樣在10%SDS中電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜浸在封閉液中低速搖勻封閉2h2h，膜取出直接放入一抗中，4℃封閉過夜；PBST洗膜，5min×5min10次；膜轉(zhuǎn)入二抗中，室溫孵育2h2h；PBST洗膜，5min×5min10次；用化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影。1.3統(tǒng)計(jì)方法本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS21SPSS21.0和GraphPadPrism8GraphPadPrism8.0軟件，結(jié)果以均數(shù)±均值±標(biāo)準(zhǔn)差()（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，分析各組糖酵解酶表達(dá)的差異。按以P<<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1不同濃度大黃酸對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的影響采用CCK8實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同濃度梯度的大黃酸（0μmol/·L-1、12.5μmol/·L-1、25μmol/·L-1、50μmol/·L100-1、100μmol/·L-1、200μmol/·L-1、400μmol/·L-1）作用24h24h后MDA-MB-231細(xì)胞活力。如圖1所示，較高濃度大黃酸產(chǎn)生抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用。在100μmol/·L-1和200μmol/·L-1時(shí)可以顯著抑制細(xì)胞活性（P<<0.01），因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇這兩個(gè)劑量為給藥濃度，給藥時(shí)間為24h。24h（圖1）。圖1大黃酸對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響。*注：與0μmol/·L-1大黃酸組比較，P?0*P?0.05。2.2細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)克隆實(shí)驗(yàn)可以表達(dá)細(xì)胞增殖的情況，結(jié)果顯示大黃酸處理后7天，與對(duì)照組比較，大黃酸組細(xì)胞克隆數(shù)量明顯減少（P<<0.05），200nM200μmol·L-1劑量抑制效果更明顯。說明大黃酸可以劑量依賴性的抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖2）。圖2大黃酸對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響。注：A：克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖；B：克隆率的統(tǒng)計(jì)圖。*：；與0μmol/·L-1大黃酸組比較，P?0*P?0.05。2.3細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)細(xì)胞遷移能力變化采用劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，遷移的距離代表了細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果顯示大黃酸作用MDA-MB-231細(xì)胞24h24h后，與對(duì)照組相比，大黃酸組劃痕較寬，細(xì)胞遷移距離??；大黃酸高濃度組，較低濃度組劃痕寬度窄，說明細(xì)胞遷移能力越弱。這表明大黃酸對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力有明顯濃度依賴抑制作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見（圖3）。圖3大黃酸對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的遷移影響。注：A：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移；B：遷移率的統(tǒng)計(jì)圖。*：；與0μmol/·L-1大黃酸組比較，P?0*P?0.05。2.4大黃酸對(duì)線粒體形態(tài)的影響為了進(jìn)一步直觀研究大黃酸對(duì)乳腺癌癌細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)的影響，運(yùn)用透射電子顯微鏡觀測(cè)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)部的線粒體形態(tài)和分布。結(jié)果如圖4顯示，對(duì)照組乳腺癌細(xì)胞的胞質(zhì)中出現(xiàn)許多氣泡樣的空泡，線粒體過度分裂，線粒體呈碎片化，分布在細(xì)胞膜旁和細(xì)胞前沿，大黃酸治療后，線粒體數(shù)目減少，多分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。這可能是大黃酸影響線粒體動(dòng)力學(xué)途徑，抑制乳腺癌細(xì)胞遷移的潛在原因。圖4大黃酸處理后乳腺癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。注：A：對(duì)照組；B：大黃酸組；N：細(xì)胞核；#：線粒體。2.5大黃酸對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Drp1、Mfn2、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響免疫印跡法結(jié)果(（圖6)5）顯示，大黃酸作用于乳腺癌癌細(xì)胞24h后，與對(duì)照組0μmol/·L-1大黃酸組比較，乳腺癌細(xì)胞Drp1、Vimentin蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低(（P<<0.05)，），Mfn2、E-cadherin蛋白升高。與100μmol/·L-1大黃酸組比較，200μmol/·L-1大黃酸組效果更顯著（P<<0.05)。見）（圖5）。圖5大黃酸對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中Drp1、Mfn2、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響。注：A：Westernblot檢測(cè)大黃酸對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Drp1、Mfn2、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)條帶；B：蛋白印跡統(tǒng)計(jì)圖。*：；與0μmol/·L-1大黃酸組比較，P?0*P?0.05。3討論中醫(yī)藥具有幾千年的歷史，積累了豐富的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，乳腺癌屬“乳巖”。中醫(yī)認(rèn)為乳癖的發(fā)生是由于情志不暢、久郁傷肝、肝氣郁滯、痰凝血瘀所致，進(jìn)一步發(fā)展氣滯陰虛，毒瘀互結(jié)從而形成乳巖。治則多為祛瘀散毒等。現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，大量的中藥提取物可有效防治腫瘤，而在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，這些植物常用于治療炎癥、淤血、癥瘕積聚等，大黃酸是是一種從大黃、何首烏等中藥中提取的蒽醌。越來越多的研究表明，大黃酸可以在體外和體內(nèi)抑制乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌等，其機(jī)制與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中多種信號(hào)通路和抑制癌基因活性和表達(dá)有關(guān)，比如可以通過抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，阻止血管生成而減緩癌癥的進(jìn)展[13,-14]。最新研究表明大黃酸可以聯(lián)合化療藥物，增強(qiáng)化療藥物的效果。Wang等[15]將阿霉素和大黃酸聯(lián)合制備為納米顆粒，兩者聯(lián)合治療通過抑制NF-κB和MMP-9的表達(dá)，不僅有效抑制了原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)，而且在體外和體內(nèi)均顯著抑制了腫瘤轉(zhuǎn)移，并更加的安全[15]。本研究結(jié)果證實(shí)大黃酸抑制乳腺癌細(xì)胞增殖可呈劑量依賴性，并可減緩乳腺癌細(xì)胞遷移。乳腺癌轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)是由癌細(xì)胞擴(kuò)散到周圍組織引起的，涉及癌細(xì)胞和微環(huán)境交互的多個(gè)步驟。癌細(xì)胞利用EMT過程獲得侵襲性和干細(xì)胞性是啟始步驟。EMT是一個(gè)進(jìn)化保守的可逆生物過程，導(dǎo)致從上皮表型向間充質(zhì)表型的轉(zhuǎn)換。形態(tài)學(xué)上，EMT表現(xiàn)為細(xì)胞失去極性、粘附性和緊密接觸，導(dǎo)致細(xì)胞脫離基底膜，同時(shí)大量的細(xì)胞骨架重排，從而將上皮細(xì)胞的形態(tài)改變?yōu)槌衫w維細(xì)胞樣的紡錘形細(xì)胞，使其具有更大的運(yùn)動(dòng)潛能，從而侵入周圍組織使其遷移到遠(yuǎn)處。本研究發(fā)現(xiàn)大黃酸可以降低間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)，升高上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)。說明大黃酸可以抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。EMT具有很大的可塑性即可以逆轉(zhuǎn)，這個(gè)過程叫做間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymalMesenchymal-epithelialtransition,，MET）。遷移后，細(xì)胞可以通過MET在新位置形成腫瘤。所以EMT不僅有助于癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而且增強(qiáng)癌細(xì)胞的耐受性和存活率，使它們能夠在遠(yuǎn)處形成新的腫瘤[16]。因此大黃酸抑制腫瘤細(xì)胞EMT，阻止細(xì)胞可塑性的瞬時(shí)動(dòng)態(tài)過程有助于阻斷轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)，防止癌細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)[17]。線粒體是一種動(dòng)態(tài)變化的細(xì)胞器，在細(xì)胞生命過程中融合和分裂，要么呈長(zhǎng)橢圓形，要么以形成網(wǎng)絡(luò)的細(xì)長(zhǎng)分支的形態(tài)出現(xiàn)，在正常細(xì)胞內(nèi)，通過相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)分裂-融合動(dòng)力學(xué)平衡，穩(wěn)定線粒體形態(tài)及在細(xì)胞中的分布，從而維持線粒體能力代謝，機(jī)體的正常生理功能[18]。但在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中，線粒體的動(dòng)力學(xué)失衡，乳腺腫瘤中線粒體過度分裂，融合減退，線粒體呈碎片化，且在細(xì)胞內(nèi)分布異常，線粒體在細(xì)胞前沿運(yùn)輸和積累，在那里促進(jìn)ATP的局部產(chǎn)生，這對(duì)于板狀足形成、細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移形成至關(guān)重要[19]，促進(jìn)乳腺腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[4]。研究證實(shí)大黃酸可以降低Drp1表達(dá)請(qǐng)確認(rèn)此處修改是否正確。，升高M(jìn)fn2蛋白表達(dá)，抑制線粒體分裂和影響線粒體在細(xì)胞內(nèi)的分布。請(qǐng)確認(rèn)此處修改是否正確。Drp1是與線立體分裂密切相關(guān)的蛋白，屬于動(dòng)力學(xué)GTPase超家族。在胞質(zhì)和線粒體外膜上均有分布，大部分分布在胞質(zhì)中，線粒體外膜上的Drp1位于線粒體分裂部位，通過不斷溢縮促使線粒體膜分裂。乳腺癌患者高表達(dá)Drp1，抑制Drp1表達(dá)可以顯著減低線粒體自噬，代謝重編程，說明Drp1在調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞代謝和生存中起重要作用[8]。線粒體分裂增加和線粒體網(wǎng)絡(luò)缺失被描述為致瘤轉(zhuǎn)化和癌癥侵襲性增加的特征，與非轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)線粒體裂變的Drp1明顯上調(diào)。癌癥進(jìn)展過程中，線粒體需要作為單個(gè)單位，脫離緊密的網(wǎng)絡(luò)組織在細(xì)胞內(nèi)移動(dòng)。在EMT過程中，細(xì)胞膜下線粒體的積聚是促進(jìn)絲狀足和板狀足形成的必要條件。研究發(fā)現(xiàn)通過敲低Drp1，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞融合，抑制線粒體在細(xì)胞核和遷移細(xì)胞前沿之間的前定位，減緩細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移程度[7]。大黃酸降低Drp1表達(dá)，抑制線粒體分裂，使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和侵襲能力明顯受損，促進(jìn)EMT從而推動(dòng)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Mfn2定位于線粒體外膜，調(diào)控線粒體的融合，維持線粒體形態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡。也同時(shí)屬于GTPase超家族,，N端為保守的GTP酶結(jié)構(gòu)域，C端為螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)。融合過程中，其C端與線粒體外膜結(jié)合，形成反式同源或異源的寡聚復(fù)合體，介導(dǎo)線粒體外膜的融合。有研究證實(shí)剔除Mfn基因可使線粒體融合效率下降，導(dǎo)致線粒體片段化及線粒體的移動(dòng)能力減弱。在乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)低表達(dá)Mfn2的預(yù)后劣于高表達(dá)的患者，敲除Mfn2基因的MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)快，集落形成迅速，腫瘤的浸潤(rùn)性強(qiáng)，Mfn2可能是通過mTORC2/AKT通徑調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡，增殖[20,-21]。本研究證實(shí)，對(duì)于三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，大黃酸升高M(jìn)fn2蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)線粒體功能和細(xì)胞增殖，但大黃酸如何通過信號(hào)通路調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的線粒體功能，尚需進(jìn)一步研究。綜上所述，大黃酸可以降低Drp1水平，升高M(jìn)fn2蛋白表達(dá)水平，從而減少線粒體分裂；降低間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)，增高上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin，從而抑制上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。研究表明，大黃酸多靶點(diǎn)降低乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的能力，抑制乳腺癌的發(fā)展，具有較好的基礎(chǔ)研究前景和臨床應(yīng)用價(jià)值。參考文獻(xiàn)：[1] 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