微波輔助萃取-分光光度法測(cè)定細(xì)梗胡枝子葉中總黃酮的含量

微波輔助萃取－分光光度法測(cè)定細(xì)梗胡枝子葉中總黃酮的含量【摘要】目的采用微波輔助萃取法提取，以分光光度法測(cè)定細(xì)梗胡枝子葉中的總黃酮含量。方法單因素法優(yōu)化微波提取條件為：使用75%乙醇，在液固比70ml/g下，加熱至75℃后持續(xù)輻射15min。結(jié)果與傳統(tǒng)的乙醇浸提法和超聲法相比，微波法具有操作簡(jiǎn)便，可靠，重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。結(jié)論微波法適合推廣于各類(lèi)中草藥中總黃酮含量測(cè)定的樣品前處理。

【關(guān)鍵詞】微波輔助萃取分光光度法細(xì)梗胡枝子總黃酮

Abstract：ObjectiveToextracttotalflavonesfromLespedezavirgata(Thunb.)DC.bymicrowave-assistedextractionanddetermineitscontentbyabsorptionspectroscopy.MethodsTheextractedconditionsofflavoneswereoptimizedas70ml/gof75%ethanoltoleaveswghtratioandsolutiontemperatureof75℃for15min.ResultsComparedwithmocerationandultrasonic-assistedextraction,microwave-assistedextractionwassimpleandaccuratewithgoodreproducibility.ConclusionItissuitableforthedeterminationofflavoneinmanykindsoftraditionalChinesemedicines.

Keywords：Microwave-assistedextraction(MAE);Absorptionspectroscopy;Lespedezavirgata(Thunb.)DC.;Flavones

胡枝子屬植物含黃酮、生物堿、萜類(lèi)、甾醇、有機(jī)酸、鞣質(zhì)等多種化學(xué)成分［1～6］，有抗炎、抗過(guò)敏、抗早孕、鎮(zhèn)痛等藥理活性，特別是黃酮類(lèi)化合物對(duì)腎功能不全的治療作用尤為顯著。細(xì)梗胡枝子為豆科植物細(xì)梗胡枝子Lespedezavirgata(Thunb.)DC.的干燥全草，可用于治療慢性腎小球腎炎、腎盂腎炎、腎結(jié)核及腎萎縮等疾病。藥研究表明，該藥所含的多種黃酮類(lèi)化合物能降低血中殘余氮，改善腎功能，影響離體子宮的作用，此外還具有抗炎、抗早孕、抗過(guò)敏及止痛等作用［6］。

自Ganzler［7］首次將微波輔助技術(shù)應(yīng)用于植物樣品提取以來(lái)，MAE在天然植物提取中的應(yīng)用越來(lái)越受到重視［8～14］。本文僅就該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于細(xì)梗胡枝子中黃酮類(lèi)化合物的提取進(jìn)行研究，并用分光光度法對(duì)總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，建立了細(xì)梗胡枝子葉中總黃酮的微波輔助萃取－分光光度測(cè)定法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1儀器與試劑

XH-100A型祥鵠電腦微波催化合成/萃取儀，具有溫度控制部件，設(shè)計(jì)溫度±1℃。U-3010/3310分光光度計(jì)。

細(xì)梗胡枝子；蘆丁標(biāo)樣；乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等試劑均為分析純。

2方法

樣品的處理

先將細(xì)梗胡枝子葉粉碎后過(guò)60目的篩子，之后用烘箱烘至恒重保存。準(zhǔn)確稱(chēng)取g細(xì)梗胡枝子粉于圓底燒瓶中，按要求加入一定量的乙醇，控制一定溫度，在一定的微波功率下微波萃取一定時(shí)間，過(guò)濾，定容，取一定量試液進(jìn)行顯色、測(cè)定。

總黃酮含量的測(cè)定

在10ml容量瓶中，取少量樣品溶液，依次加入若干毫升的NaNO2溶液，Al(NO3)3溶液和NaOH溶液，然后用乙醇溶液定容至10ml，于室溫下放置10min，用1cm比色皿，以試劑空白為參比，在選定波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度［15，16］。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得總黃酮的提取率，其計(jì)算公式為：提取率(mg/g)＝X×V/m，其中X是從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得的濃度值，V為萃取液體積，m為細(xì)梗胡枝子葉的質(zhì)量。

3結(jié)果

測(cè)定波長(zhǎng)的選擇取適量總黃酮萃取液進(jìn)行顯色反應(yīng)，用分光光度計(jì)對(duì)其紅色產(chǎn)物在400～700nm之間掃描，在510nm處有最大吸收，所以確定510nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

顯色反應(yīng)時(shí)間的確定準(zhǔn)確吸取一定量樣品溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法在0～60min范圍內(nèi)，每隔5min測(cè)定其吸光度考察反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，黃酮顯色產(chǎn)物在前30min內(nèi)吸光度基本不變，但在30min后，吸光度開(kāi)始略有下降，因此其吸光度應(yīng)控制在定容后前30min內(nèi)測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立精確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用75%乙醇水溶液定容至100ml容量瓶中，配好冷藏放置于冰箱中。分別取，，，，，ml標(biāo)準(zhǔn)液于10ml容量瓶中，分別加入一定量的75%乙醇水溶液稀釋成ml。加入5%NaNO2溶液ml，搖勻，放置6min；再加入10%的Al(NO3)3溶液ml，搖勻，再放置6min；加4%的NaOH溶液ml，用水稀釋至刻度，放置10min，在分光光度計(jì)上，以試劑空白為參比于510nm處測(cè)其吸光度，得到回歸方程為：A=7(r=7)，式中A為吸光度，C為溶液中蘆丁的濃度(g/ml)。該方程在所測(cè)范圍內(nèi)(5～25g/ml)線(xiàn)性關(guān)系良好。

微波輔助萃取法的單因素實(shí)驗(yàn)

乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

本文用乙醇溶液作為提取體系，考察了乙醇濃度對(duì)微波萃取細(xì)梗胡枝子葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)1。由圖1可見(jiàn)，總黃酮提取率隨乙醇濃度的增大先呈上升趨勢(shì)，在乙醇濃度為75%時(shí)達(dá)到最大，之后乙醇濃度再增大時(shí)，提取率呈下降趨勢(shì)，因此考慮選75%乙醇作提取劑為宜。

液固比對(duì)黃酮提取率的影響

在其他條件相同下，不同溶劑用量對(duì)黃酮提取率的關(guān)系如2所示。從圖2可知，提取率隨著液固比的增大而呈上升趨勢(shì)，但增大到70ml/g后就趨于下降，之后實(shí)驗(yàn)中選擇液固比為70ml/g。

溶液溫度對(duì)黃酮提取率的影響

在其他條件相同下，得黃酮提取率與溶液溫度的關(guān)系，見(jiàn)圖3。由圖3可知，75℃以前總黃酮提取率隨功率增加呈現(xiàn)上升，75℃后開(kāi)始下降。因此實(shí)驗(yàn)中溶液溫度最好控制在75℃。

微波輔助提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

在其他條件相同下，考察了黃酮提取率與微波輔助提取時(shí)間的關(guān)系，見(jiàn)圖4。由圖4可知，提取率隨微波輻射時(shí)間的增加而呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。從時(shí)間效益考慮，微波時(shí)間應(yīng)控制在15min。

最佳條件下的重復(fù)性和回收率實(shí)驗(yàn)

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批細(xì)梗胡枝子葉樣品5份，在最佳條件下進(jìn)行萃取，分別測(cè)定各自的總黃酮含量，結(jié)果表明其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為%。

加樣回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量樣品9份，加入不同量的蘆丁對(duì)照品溶液在相同微波條件下進(jìn)行萃取，萃取物按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果表明回收率在99%～102%之間，說(shuō)明此方法有較好的準(zhǔn)確度。

微波法與乙醇浸提法及超聲波萃取法的比較

本實(shí)驗(yàn)了乙醇浸提法和超聲波萃取法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。乙醇浸提法：溫度75℃，乙醇濃度75%，液固比35ml/g，連續(xù)提取2次，第1次3h，第2次3h，平均提取率為mg/g。超聲波提取法：100W微波功率，超聲波萃取30min，乙醇濃度75%，液固比70ml/g，平均提取率為mg/g。以上各種萃取方法結(jié)果對(duì)比列于表1中。由表1可以看出，微波法僅用15min卻比乙醇浸提6h的提取率高出倍，比超聲波提取法高出倍。從節(jié)能、省時(shí)和試劑消耗等多方面角度來(lái)看，微波法優(yōu)于乙醇浸提法和超聲波提取法。表1樣品分析結(jié)果

4結(jié)論

本文主要對(duì)微波輔助萃取法萃取細(xì)梗胡枝子葉中總黃酮進(jìn)行了初步研究，由重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)和加樣回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，本文建立的萃取方法和測(cè)定方法可靠，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便。微波輔助萃取與乙醇浸提法的比較表明，微波輔助萃取法具有快速、提取率高、溶劑用量少等特點(diǎn)。本法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，重復(fù)性好，穩(wěn)定性好，可廣泛用于各種中草藥中黃酮類(lèi)物質(zhì)含量的測(cè)定。

【參考文獻(xiàn)】

［1］國(guó)家中醫(yī)藥局《中華本草》編委會(huì).中華本草［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999,4:3243.

［2］ToshioM,MitsuakiS,HarukoN,etal.AntioxidantsfromLespedezahomoloba(I)［J］.Phytochemistry,1999,52:303.

［3］MaximovOB,KuleshNI,StepanenkoLS,etal.NewprenylatedisoflavanonesandotherconstituentsofLespedezabicolor［J］.Fitoterapia,2004,75:96.

［4］譚莉,張秀鳳,劉揚(yáng),等.細(xì)梗胡枝子全草中5種黃酮化合物的結(jié)構(gòu)解析［J］.中草藥,2008,39(2):189.

［5］LiTan,Xiu-FengZhang,Bao-ZhenYan,etal.AnovelflavonoidfromLespedezavirgata(Thunb.)DC.:Structuralelucidationandantioxidativeactivity［J］.Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,2007,17:6311.

［6］王威,閆喜英,王永奇,等.胡枝子屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展［J］.中草藥,2000,31(2):144.

［7］GanzlerK.,SzinaiI.,SalgóA..Effectivesamplepreparationmethodforextractingbiologicallyactivecompoundsfromdifferentmatricesbyamicrowavetechnique［J］.J.Chromatogr.A,1990,520:257.

［8］董彩玉,鄭慶偉,楊屹,等.微波間歇萃取-分光光度法測(cè)定三七中總皂苷［J］.分析試驗(yàn)室,2007,26(S1):10.

［9］張帆,楊屹,郭振庫(kù).微波輔助萃取鬼箭羽葉中蘆丁和槲皮素［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2007,28(8):1480.

［10］顏流水,黃智敏,胡臻愷,等.藜蒿中黃酮類(lèi)化合物的微波輔助萃取研究［J］.分析試驗(yàn)室,2006,25(3):66.

［11］陳雷,楊屹,張新祥,等.密閉微波輔助萃取丹參中有效成分的研究［J］.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào),2004,25(1):35.

［12］阮貴華,陳皓,肖小華,等.微波輔助提取-GC/MS聯(lián)用分析蒼耳子中油脂成分的研究［J］.分析試驗(yàn)室,2007,26(3):21.

［13］侯翔燕,楊屹,郭振庫(kù).微波輔助萃取新鮮蘆薈葉中蘆薈甙的研究［J］.高