第三代測序技術(shù)簡介

第三代測序技術(shù)簡介z2011-09-2517:27:45|分類：Biology|標(biāo)簽：|字號大中小訂閱如果有人告訴你用顯微鏡實(shí)時觀測單分子DNA聚合酶復(fù)制DNA,并用它來測序，你一定會認(rèn)為他異想天開，沒有一點(diǎn)生物的sense。我最初就是這樣認(rèn)為的，然而它不僅可以實(shí)現(xiàn)，而且已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了！這個就是被稱為第三代的測序技術(shù)，PacificBiosciences公司推出的“SingleMoleculeRealTime（SMRT?）DNASequencing"（單分子實(shí)時DNA測序）。我有幸在NIH聽到了這個技術(shù)發(fā)明人StephenTurner博士的講座，根據(jù)自己粗淺的理解記錄整理一下。要實(shí)現(xiàn)單分子實(shí)時測序，有三個關(guān)鍵的技術(shù)。第一個是熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸。顯微鏡現(xiàn)在再厲害，也不可能真的實(shí)時看到“單分子”。但是它可以實(shí)時記錄熒光的強(qiáng)度變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時候，它的熒光就同時能在DNA鏈上探測到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時候，它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸不會影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。第二個是納米微孔。因?yàn)樵陲@微鏡實(shí)時記錄DNA鏈上的熒光的時候，DNA鏈周圍的眾多的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸形成了非常強(qiáng)大的熒光背景。這種強(qiáng)大的熒光背景使單分子的熒光探測成為不可能。PacificBiosciences公司發(fā)明了一種直徑只有幾十納米的納米孔［zero-modewaveguides（ZMWs）］,單分子的DNA聚合酶被固定在這個孔內(nèi)。在這么小的孔內(nèi)，DNA鏈周圍的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G這四種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸非?？焖俚貜耐饷孢M(jìn)入到孔內(nèi)又出去，它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號。而當(dāng)某一種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時，這種特定顏色的熒光會持續(xù)一小段時間，直到新的化學(xué)鍵形成，熒光基團(tuán)被DNA聚合酶切除為止（見圖）。第三個是共聚焦顯微鏡實(shí)時地快速地對集成在板上的無數(shù)的納米小孔同時進(jìn)行記錄。由于我對顯微原理的物理知識匱乏，而

PacificBiosciences公司又沒有非常強(qiáng)調(diào)在這方面的發(fā)明，不做進(jìn)一步探討。他們還對這一技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。第一個是把雙鏈DNA環(huán)化反復(fù)測序。人們可以在雙鏈DNA的兩頭連上發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNAadaptor，從而使DNA環(huán)化。而DNA聚合酶就能夠以環(huán)化的DNA作為模板滾環(huán)復(fù)制，反復(fù)測一段DNA序列。這種反復(fù)測序，糾正了偶爾出現(xiàn)的復(fù)制錯誤，從而使測序精度非常高。第二個是激發(fā)光中斷測序法。DNA聚合酶雖然很穩(wěn)定，但是在強(qiáng)大的激發(fā)光作用下酶也是有一定壽命的。如果把激發(fā)光中斷一段時間，在這段時間內(nèi)DNA聚合酶繼續(xù)復(fù)制DNA，當(dāng)激發(fā)光重新開啟以后，人們就可以測到長DNA鏈后面的序列。第三代測序技術(shù)非?？膳隆?、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測10個堿基，測序速度是化學(xué)法測序的2

萬倍。2、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長的片段），一個反應(yīng)

就可以測非常長的序列。二代測序現(xiàn)在可以測到上百個堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個堿基。這為基因組的重復(fù)序列

的拼接提供了非常好的條件。3、它的精度非常高，達(dá)到99.9999%。此外，它還有兩個應(yīng)用是二代測序所不具備的。第一個是直接測RNA的序列。既然DNA聚合酶能夠?qū)崟r觀測，那么以RNA為模板復(fù)制DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以。RNA的

直接測序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。第二個是直接測甲基化的DNA序列。實(shí)際上DNA聚合酶復(fù)制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時間不同。根據(jù)這個不同的時間，可以判斷模板的C是否甲基化。PacificBiosciences公司預(yù)計2010年或者2011年就會推出商業(yè)化的測序儀器。在不遠(yuǎn)的將來，如果他們能和二代測序一樣集成100萬個納米微孔，那么一臺儀器15分鐘就能夠準(zhǔn)確地測出一個人的基因組。以后每個人的基因組測序成本將變成100美元，人人都可以消費(fèi)得起。想想人類基因組計劃耗資30億美元，費(fèi)時十幾年，無數(shù)科學(xué)家參與其中，技術(shù)的革新意義是多么重大?。〗榻B完三代測序技術(shù)之后，請允許我販賣點(diǎn)私貨：1、 創(chuàng)新創(chuàng)新再創(chuàng)新。國內(nèi)多數(shù)導(dǎo)師為了掩飾自己idea的匱乏，極力壓制學(xué)生的冒險欲望，鼓勵學(xué)生對一個小的問題花無數(shù)的時間用data堆成文章。其實(shí)想做真正有挑戰(zhàn)性的課題的想法是非?？少F的，導(dǎo)師一個很重要的功能是幫助學(xué)生評估他們想法的可行性，在可行的情況下盡量提供條件讓他們自己去闖。從想做真正科研的學(xué)生的角度來說，讓那些不能激動你的保險課題見鬼去吧，花大力氣去尋找一些真正能貢獻(xiàn)科學(xué)，貢獻(xiàn)社會的課題，不要害怕一時的挫折，這是科研的真意！2、 不要鄙視公司。有很多人以為學(xué)院派的科研是最好的，其實(shí)真正推動科學(xué)進(jìn)步的絕不僅僅是發(fā)生在學(xué)校和研究所的科研。公司同樣能做非常令人暈眩的研究，經(jīng)濟(jì)意義，社會效益有時候恐怕遠(yuǎn)甚于學(xué)院派研究。美國的許多應(yīng)用研究就是在公司里面完成的。3、 學(xué)科交叉。緊咬你的可貴想法，然后橫跨各個學(xué)科，自己學(xué)或者尋合作者。光是生物背景，想要發(fā)明第三代測序技術(shù)，那就是個笑話。三代DNA測序技術(shù)的基本技術(shù)原理z2011-09-2517:15:42|分類：Biology|標(biāo)簽：|字號大中小訂閱本文引用自xue19870214《二代dna測序技術(shù)的基本技術(shù)原理》第一代測序技術(shù)是雙脫氧鏈末端終止法—一根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個特定的堿基處終止，生A，T，C，G四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測，從而獲得）NA序列。自上世紀(jì)90年代初，所有的DNA測序操作幾乎無一例外地全部采用半自動化毛細(xì)管電泳Sanger測序法。而后來出現(xiàn)的高通量測序方法則首先采用以下兩種方法中的一種DNA進(jìn)行預(yù)處理。就1時口陽進(jìn)行枝處理的兩種方法此法也可見干隊展測但的烏槍注（that^un navaMquanEingJ,艮」羌將大置煩機(jī)切物產(chǎn)生的命上小令子"段完暖到度捉貝數(shù)隹牡〔牌松池巨隹牡；=.（5后再治這堅隹粒月干K膀桿前琴化*此注是在時特定序列進(jìn)行耳次測佐時墮月的方法.引蔬用謨待定停列的特#31構(gòu)進(jìn)行PCR打坷.m無論采用以上哪種方法處理后，我們均可以得到大量的待測序模板片一質(zhì)粒或PCR產(chǎn)物。隨后，測序儀會進(jìn)行循環(huán)測序”反應(yīng)。在每一輪測序反應(yīng)的引物延伸步驟中，會隨機(jī)引入已被四種不同顏色熒光分別標(biāo)記的dNTP（ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP）以終止延伸反應(yīng)。這樣就形成了大量末端被熒光標(biāo)記的、長短不一（終止位點(diǎn)不同）的延伸產(chǎn)物。接著，再用高分辨率的毛細(xì)管凝膠電泳分離這些延伸產(chǎn)物，通過對延伸產(chǎn)物末端四種不同熒光顏色的區(qū)分，計算機(jī)軟件會自蜀讀出”DNA序列。不過，該方法在讀取'每一個堿基信息時都有可能出錯。后續(xù)操作中，比如基因組組裝或者找出變異位點(diǎn)等就是具體情況具體解決了。一般，這種高通量測序儀一次最多只能同時進(jìn)行個或384個樣品測序。SangerDNA測序技術(shù)經(jīng)過了30年的不斷發(fā)展與完善，現(xiàn)在已經(jīng)可以對長達(dá)1,000bp的DNA片段進(jìn)行測序了，而且對每一個堿基的讀取準(zhǔn)確率高

達(dá)99.999%。在高通量基因組鳥槍法測序操作當(dāng)中，使慰anger測序法的費(fèi)用大約為0.5美元/1,000個堿基。原文檢索：JayShendure&HanleeJi.(2008)Next-generationDNAsequencingitureBiotechnologj26(10):1135-1145.在第一臺全自動測序儀出現(xiàn)之前使用最為廣泛的測序方法就是Sanger在20世紀(jì)70年代中期發(fā)明的末端終止法測序技術(shù)Sanger也因此獲得1980年的諾貝爾化學(xué)獎5］.他的發(fā)明第一次為科研人員開啟了深入研究生命遺傳密碼的大門第二代測序技術(shù)是焦磷酸測序*一由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，適于對已知的短序列的測序分析。3 口3 口N夫分衛(wèi)岷尾機(jī)切用成y片船b DN快分子楊隨機(jī)切粕成小片段制成pcilony芯片￥...右拓制成pcilony芯片￥...右拓WGA飽CG焰CGHSA…占模槌5—、QTGAT i□引翎...CTGArtl-..CTGATCTA-^-...CTGiffCTAT理目習(xí)..CTGArCWfiCI七九dNTP￡-..CTGATCW<3CTC：.熒元標(biāo)記的ddNTP■■CTG^GWCCTCG^芯H侑輯湫聲［每個芯片可以獲得長壹卜過芯H侑輯湫聲［每個芯片可以獲得長壹卜過I；叩的序舛〔蒼叛地泌讀聚一吊誠基悟息)H-AMAAAS(1Tr^-.F?3算三括耳基是付幻密：專快凱Ssfm,溫泮活&一代口NA：,.存疫術(shù)工停流程函，沱，S31S^S^3e-7-.iS.百無戛因由口NU蚯的匚可*..弓小片段分于-些薯盤務(wù)小片祈口村點(diǎn)喧克孕人商貯此■4；6=町^柬.大表料函中.最后落養(yǎng)大場軒葫!1取屈桂.既行跚序.樁一個凋序反應(yīng)用在只有凡械丹的反應(yīng)炸系中芫吸.■:.?.序后麻遺一抵靈任盾不一此京村咤.?己與熒光皂忙成盤走酒乏克塹一個姑％互五產(chǎn)tt末點(diǎn)艾光虹至里行技兄來■取DNA序孑..鳥些"歹芯.=.如W活.百立揮堇因距CINAT廠只筆W小甘氐DNA分子標(biāo)后在這些小片WD!^.升子佻末戒長果上有沔禮生乂簸后用嬉也小片版DbP■分于乏.茗技。的西片.垂一個M-.-y1=t：^=-個小片云UM%分子EC*務(wù)個喝里.停S這欄Mb?！奔谝惶贿对偈诵緫?這攔一次二序厘古學(xué)苛以向廠穴立弟的k■凸方蹴氣噩.手.戶運(yùn)與mv：::亍流中一斥酒迂互至一個芷監(jiān)反底盧格末f艾光敬古洼斤沮二來添我土UMA凈歹..S3［上述那用氣就我用完服三序完“polony芯片(Polonyisacontractionof"polymerasecolony,"asmallcolonyofDNA.):該方法是由瑞士日內(nèi)瓦雪蘭諾制藥研究中心的EricKawashima俄羅斯科學(xué)院的AlexanderChetverin和當(dāng)時在美國哈佛大學(xué)的密特拉共同開發(fā)的。他們制作出了可排列在載玻片或凝膠分子層上的一個個獨(dú)立的聚合酶群落，成為polony，每一個聚合酶群落里都含有一個DNA模板分子，通過PCR反應(yīng)就可以獲得大量的模板。這些擴(kuò)增后的聚合酶群落就像菌落一樣一個個散布在載玻片或凝膠分子層上，成polony芯片。每一個polony直徑約為1pm，一個芯片上可以承載數(shù)十億個聚合酶群落(即“高通量性”)。兩代測序方法，測序序列都是在熒光或者化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的協(xié)助下，通過讀取NA聚合酶或DNA連接酶將堿基連接到DNA鏈上過程中釋放出的光學(xué)信號而間接確定的，除了需要昂貴的光學(xué)監(jiān)測系統(tǒng)還要記錄、存儲并分析大量的光學(xué)圖像，這都使儀器的復(fù)雜性和成本增加，依賴生物化學(xué)反應(yīng)讀取堿基序列更增加了試劑、耗材的使用。JayShendure&HanleeJi.(2008)Next-generationDNAsequencing.NatureBiotechnology,26(10):1135-1145.JonathanMRothberg&JohnHLeamon.(2008)ThedeVopmentandimpactof454sequencing.NatureBiotechnology,26(10):1117-1124.而第三代測序技術(shù)則是基于納米孔的單分子讀取技術(shù)，這種方法讀取數(shù)據(jù)更快、有望大大降低測序成本，改變個人醫(yī)療的前景。第三代測序技術(shù)的基本原理是新型納米孔測序法(nanoporesequencing，它采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動單個分子逐一通過納米孔來實(shí)現(xiàn)測序的。由于納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個核酸聚合物通過，因而可以在此基礎(chǔ)上使用多種方法來進(jìn)行高通量檢測。此外，納米級別的孔徑保證了檢測具有良好的持續(xù)性，所以測序的準(zhǔn)確度非常高。對于長達(dá),000個堿基的單鏈DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本無需進(jìn)行擴(kuò)增或標(biāo)記就可以使用納米孔測序法進(jìn)行檢測，這使得便宜、快速地進(jìn)彳DNA測序成為可能。如果對現(xiàn)有納米孔測序法進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)展和改進(jìn)，那么它將有望成為第三代測序技術(shù)(也可稱為下、下一代測序技術(shù))，從而幫助人們實(shí)現(xiàn)4小時內(nèi)只花費(fèi)1,000美元完成二倍體哺乳動物基因組測序這一目標(biāo)。如果納米孔測序技術(shù)能夠成功，那么它將是非常好的一種新的測序技術(shù)，因?yàn)樗哂幸韵聝?yōu)點(diǎn)品準(zhǔn)備極其簡單；不需要借助堿基、多聚酶、連接酶等就能進(jìn)行測序，而且測序的長度可以達(dá)到0,000~50,000nt因此，一個成功的納米孔測序儀其測序費(fèi)用應(yīng)該非常低廉，極有可能達(dá)到H設(shè)定的只用1,000美元就能完成個人基因組測序的目標(biāo)。同時納米孔測序儀本身不會太貴。如果能在一個測序芯片上整合00個納米孔以及相應(yīng)的微流體系統(tǒng)和電子探針系統(tǒng)，那么對一個人類基因組進(jìn)行六倍覆蓋率的測序也只需要一天的時間。不過，納米孔測序技術(shù)還是面臨著很大的問:如，如何減慢DNA通過納米孔的速度，使每一個堿基通過納米孔的時間從微秒級上升至毫秒級