理工大課件常用臨床病原學(xué)檢測

理工大課件常用臨床病原學(xué)檢測演示文稿當(dāng)前第1頁\共有45頁\編于星期三\6點（優(yōu)選）理工大課件常用臨床病原學(xué)檢測當(dāng)前第2頁\共有45頁\編于星期三\6點一、標(biāo)本采集和運送3（一）微生物標(biāo)本采集的一般原則：1.早期采集：采集時間最好是病程早期、急性期或癥狀典型時，而且必須在使用抗生素或其他抗菌藥物之前采集。2.無菌采集：

采集的標(biāo)本應(yīng)無外源性污染。在采集血液、腦脊液、胸腔積液、關(guān)節(jié)液等無菌標(biāo)本時，應(yīng)注意對局部及周圍皮膚的消毒，嚴(yán)格進行無菌操作；對于與外界相通的腔道，如竇道標(biāo)本應(yīng)由竇道底部取活組織檢查，而不應(yīng)從竇道口取標(biāo)本，以免受皮膚表面正常菌群的污染，造成混淆和誤診；對于從正常菌群寄生部位（如口腔）采集的標(biāo)本，應(yīng)明確檢查的目的菌，在進行分離培養(yǎng)時，采用特殊選擇性培養(yǎng)基。采集的標(biāo)本均應(yīng)盛于無菌容器內(nèi)，盛標(biāo)本的容器須先經(jīng)高壓滅菌、煮沸、干熱等物理方法滅菌，或用一次性無菌容器，而不能用消毒劑或酸類處理。當(dāng)前第3頁\共有45頁\編于星期三\6點43.方法得當(dāng)：

即根據(jù)檢測的目的菌采用適宜的方法。如，厭氧菌、需氧或兼性厭氧菌，以及L型菌采用的方法不同。如尿液標(biāo)本，疑為厭氧菌感染時，應(yīng)以無菌注射器從恥骨上緣行膀胱穿刺術(shù)抽??；若懷疑是需氧或兼性厭氧菌的感染。則可通過自然導(dǎo)尿獲取標(biāo)本。4.標(biāo)本適量：

采集量不應(yīng)過少或過多，而且要有代表性，同時有些標(biāo)本還要注意在不同時間采集不同部位標(biāo)本。如腸熱癥患者，發(fā)病的第1周應(yīng)采集血液，第2周應(yīng)采集糞便和尿液。否則影響細菌檢出率。5.安全采集：

采集標(biāo)本時不僅要防止皮膚和黏膜正常菌群對標(biāo)本的污染。同時也要注意安全，防止傳播和自身感染。當(dāng)前第4頁\共有45頁\編于星期三\6點5（二）微生物標(biāo)本運送的一般原則：1.及時送檢！

----標(biāo)本采集后應(yīng)立即送至微生物學(xué)實驗室。

----標(biāo)本采集后在室溫下超過2h未送達實驗室者可視為不合格標(biāo)本。2.標(biāo)識無誤！

----送檢標(biāo)本必須與檢驗申請單有相同的唯一標(biāo)識，而且送檢標(biāo)本應(yīng)注明標(biāo)本來源和檢驗?zāi)康摹?.正確運送！如：棉拭子宜用運送培養(yǎng)基；可能混有正常菌群的標(biāo)本不能用肉湯培養(yǎng)基運送；血培養(yǎng)瓶室溫運送；尿液標(biāo)本不能及時送檢時，可4℃冷藏，但若用于淋病奈瑟菌培養(yǎng)時則需室溫保存和運送；胸腹水等無菌體液可用無菌小瓶送檢，也可直接注入血培養(yǎng)瓶中送檢，等等。當(dāng)標(biāo)本不能及時送檢時，應(yīng)使用運送培養(yǎng)基。4.安全運送！----標(biāo)本在運送過程中保證無滲漏、無污染等。當(dāng)前第5頁\共有45頁\編于星期三\6點6（一）直接顯微鏡檢測法（即形態(tài)學(xué)檢查）----涂片染色法：常用的有革蘭染色、抗酸染色，主要用于直接觀察細菌形態(tài)、染色性狀或觀察宿主細胞內(nèi)包涵體的特征等。----懸滴法或壓片法：需借助暗視野顯微鏡或相關(guān)顯微鏡，主要用于觀察病原體的生長、運動方式、螺旋體的形態(tài)或動動。2.病原體特異性抗原檢測

----用已知抗體，借且免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)、化學(xué)發(fā)光技術(shù)、膠乳凝集試驗、對流免疫電泳等技術(shù)檢測標(biāo)本中未知的病原體抗原。二、微生物檢查方法當(dāng)前第6頁\共有45頁\編于星期三\6點形態(tài)學(xué)檢查革蘭氏染色7當(dāng)前第7頁\共有45頁\編于星期三\6點（三）病原體的分離培養(yǎng)和鑒定微生物培養(yǎng)分類血培養(yǎng)自動培養(yǎng)細菌培養(yǎng)真菌培養(yǎng)8當(dāng)前第8頁\共有45頁\編于星期三\6點細菌鑒定形態(tài)學(xué)檢查生物化學(xué)檢查法免疫學(xué)檢查法分子生物學(xué)檢查法生物學(xué)檢查法9當(dāng)前第9頁\共有45頁\編于星期三\6點細菌鑒定菌落大小菌落顏色溶血特點產(chǎn)色素情況氣味革蘭染色鏡檢真菌濕片鏡檢抗酸染色鏡檢墨汁染色G-菌：氧化酶、OF葡萄球菌屬：觸酶、凝固酶b溶血鏈球菌：血清凝集試驗?zāi)c球菌屬：高鹽、膽七試驗形態(tài)學(xué)菌落特征生化鑒定10當(dāng)前第10頁\共有45頁\編于星期三\6點111.形態(tài)學(xué)檢查一、觀察細菌的培養(yǎng)特征來判斷，觀察內(nèi)容包括：細菌培養(yǎng)物的顏色、氣味、溶血性、菌落形態(tài)、細菌動力及在液體、半固體、固體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)；二、顯微鏡檢查：借助各種顯微鏡可對細菌形態(tài)、基本結(jié)構(gòu)、排列方式、數(shù)量、活體狀態(tài)、運動特征等進行直觀檢查，對樣本中細菌的含量和種類做出大致判斷。當(dāng)前第11頁\共有45頁\編于星期三\6點2.生物化學(xué)檢查法生物化學(xué)法又叫生化反應(yīng)試驗，它是利用各種不同細菌在進化中形成的獨特的酶系統(tǒng)，在其生長環(huán)境中加入相應(yīng)作用底物和指示劑，經(jīng)培養(yǎng)一定時間后，細菌的代謝產(chǎn)物呈現(xiàn)肉眼可見或儀器可分析的變化，根據(jù)這些變化可對細菌的種類進行鑒別。糖代謝試驗；蛋白質(zhì)代謝試驗；碳源和氮源利用試驗；氧化酶、接觸酶等單項檢測試驗。12當(dāng)前第12頁\共有45頁\編于星期三\6點對于工作經(jīng)驗很豐富的檢驗人員，雙歧法也不失為一種簡便而有效的細菌鑒定方法，這個方法所選用的測試特異性很好。測試1測試2（1）雙歧法：工作量大、工作效率低、準(zhǔn)確性差、人為因素。

13未知菌+—+—+—測試3當(dāng)前第13頁\共有45頁\編于星期三\6點（2）數(shù)值法：將細菌的形態(tài)和理化特征用數(shù)字表示，按照數(shù)學(xué)理論的方法將反應(yīng)譜進行數(shù)字處理最后得出結(jié)果。數(shù)值鑒定的流程分離平板鑒定結(jié)果孵育調(diào)配菌液測試組合分離平板鑒定結(jié)果孵育調(diào)配菌液測試組合分離平板鑒定結(jié)果孵育調(diào)配菌液測試組合14當(dāng)前第14頁\共有45頁\編于星期三\6點15當(dāng)前第15頁\共有45頁\編于星期三\6點結(jié)果判讀查詢編碼冊或軟件16當(dāng)前第16頁\共有45頁\編于星期三\6點17當(dāng)前第17頁\共有45頁\編于星期三\6點

免疫學(xué)檢查又叫血清學(xué)檢查，它是利用抗體-抗原反應(yīng)在細菌感染的種類、性質(zhì)、部位及病人的感染程度進行特異性診斷，包括：沉淀反應(yīng)：可溶性抗原與相應(yīng)抗體相混合，在一定條件下，形成肉眼可見的沉淀物。應(yīng)用于如鏈球菌、肺炎鏈球菌、鼠疫耶爾森菌的鑒定凝集反應(yīng)：顆粒性抗原與相應(yīng)抗體可發(fā)生特異性結(jié)合，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的凝集小塊。用于沙門菌、志賀菌、致病性大腸埃希菌、霍亂弧菌、布氏桿菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌及鏈球菌等的鑒定。莢膜腫脹試驗：常用于肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和炭疽芽胞梭菌等檢測。制動試驗：主要用于霍亂弧菌的快速鑒定。3.免疫學(xué)檢查法18當(dāng)前第18頁\共有45頁\編于星期三\6點194.分子生物學(xué)檢查法應(yīng)用分子生物學(xué)方法進行細菌檢測，如部分的核酸雜交技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）及質(zhì)粒指紋圖譜技術(shù)，還有逐漸成熟的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)及DNA芯片技術(shù)。---全自動細菌鑒定飛行質(zhì)譜儀（簡單介紹）當(dāng)前第19頁\共有45頁\編于星期三\6點二、細菌耐藥性檢查常用檢測細菌耐藥性的方法為：KB法（即紙片擴散法）：根據(jù)紙片中所含藥物的抑菌環(huán)大小來判斷。抑菌環(huán)越大越敏感。優(yōu)點：選藥靈活、便宜、一個平皿可測多個藥缺點：影響因素多MIC法：檢測能夠抑制被測菌生長的最低藥物濃度，MIC值越小越敏感。優(yōu)點：操作容易（一次可操作檢測多種藥物）；敏感株的MIC呈正態(tài)分布；已實現(xiàn)自動化等20當(dāng)前第20頁\共有45頁\編于星期三\6點藥敏試驗折點的建立

1.MIC的分布

2.藥代動力學(xué)和藥效學(xué)

定MIC的折點3.臨床療效和細菌清除率4.抑菌圈直徑的分布…定抑菌圈折點當(dāng)前第21頁\共有45頁\編于星期三\6點藥代動力學(xué)和藥效學(xué)藥代動力學(xué)：藥物吸收，分布，代謝，排泄藥效學(xué)：藥物對機體的作用時間依賴型（％T>MIC〕：β－內(nèi)酰胺類，大環(huán)內(nèi)酯類濃度依賴型（AUC/MIC比率〕：AGS,FQ這些參數(shù)可用于計算具有最佳藥效的給藥方案當(dāng)前第22頁\共有45頁\編于星期三\6點23選藥原則

主要根據(jù)細菌種類和抗生素作用機制選藥。選擇試驗的藥物應(yīng)具有確切的臨床療效，試驗藥物的體外試驗結(jié)果可以接受，并且試驗藥物具有代表性。當(dāng)前第23頁\共有45頁\編于星期三\6點預(yù)報用藥

測試藥 菌名推測其它藥物的敏感性

苯唑西林 葡萄球菌 所有β-內(nèi)酰胺類四環(huán)素 所有（除葡 多西環(huán)素，米諾環(huán)素

萄球菌和不 動桿菌〕紅霉素 G＋球菌羅紅霉素，克拉霉素，阿奇霉素克林霉素 所有 林可霉素當(dāng)前第24頁\共有45頁\編于星期三\6點測試藥菌名推測其它藥物的敏感性氨芐西林腸球菌 青霉素青霉素G葡萄球菌

氨芐，美洛，替卡頭孢噻吩

腸桿菌科

拉定，氨芐，克羅萬古霉素s

所有

替考拉寧s奈啶酸

腸桿菌科

所有FQs預(yù)報用藥當(dāng)前第25頁\共有45頁\編于星期三\6點報告結(jié)果方式

敏感（S）用常規(guī)用量治療有效常規(guī)用藥時達到的平均血藥濃度超過細菌的MIC5倍以上。耐藥（R）用常規(guī)用量治療不能抑制細菌的生長MIC高于藥物在血、體液中可能達到的濃度當(dāng)前第26頁\共有45頁\編于星期三\6點中介(I)MIC接近血、體液中藥物的濃度，治療反應(yīng)率低于敏感株藥物生理濃集部位有效(尿－FQ)加大用藥劑量可能有效非敏感（NS）：由于沒有耐藥菌株或耐藥菌發(fā)生罕見，此分類特指僅有敏感解釋標(biāo)準(zhǔn)的分離菌株。報告結(jié)果方式當(dāng)前第27頁\共有45頁\編于星期三\6點當(dāng)前第28頁\共有45頁\編于星期三\6點ESBL篩選和確證大腸埃希菌肺炎克雷伯菌產(chǎn)酸克雷伯菌奇異變形桿菌頭孢泊肟≤17mm（或MIC≥8ug/ml)頭孢他啶≤22mm（或MIC≥2ug/ml)頭孢噻肟≤27mm（或MIC≥2ug/ml)頭孢曲松≤25mm（或MIC≥2ug/ml)氨曲南≤27mm（或MIC≥2ug/ml)頭孢泊肟≤22mm（或MIC≥8ug/ml)頭孢他啶≤22mm（或MIC≥2ug/ml)頭孢噻肟≤27mm（或MIC≥2ug/ml)初篩初篩頭孢他啶/克拉維酸-頭孢他啶和頭孢噻肟/克拉維酸-頭孢噻肟=抑菌圈直徑增大值≥5mm(或MIC減低≥3個倍比稀釋度）判為產(chǎn)ESBL確證確證目前國家規(guī)定需監(jiān)測ESBLs的菌株是：大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌和奇異變性桿菌。

當(dāng)前第29頁\共有45頁\編于星期三\6點ESBL解讀：（一）ESBLs陽性（+）：若實驗室采用CLSIM100-S19及之前的標(biāo)準(zhǔn)，則需要將所有青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南修訂為耐藥。當(dāng)使用當(dāng)前的解釋標(biāo)準(zhǔn)時（采用CLSIM100-S26標(biāo)準(zhǔn)），在報告結(jié)果前不再需要常規(guī)測試ESBL（即，不再需要將青霉素類、頭孢菌素類或氨曲南結(jié)果從敏感修正為耐藥）。（即檢測為敏感即為敏感，耐藥即為耐藥）。然而，為了流行病學(xué)調(diào)查或感染控制目的仍可測試ESBL。當(dāng)前第30頁\共有45頁\編于星期三\6點ESBL解讀：氨芐西林測試結(jié)果可用于預(yù)報阿莫西林結(jié)果。在許多國家供貨有限藥物（如，拉氧頭孢、頭孢尼西、頭孢孟多和頭孢哌酮）的解釋標(biāo)準(zhǔn)沒有被評估，假如考慮使用這些藥物治療大腸埃希菌、克雷伯菌或變形桿菌引起的感染，應(yīng)執(zhí)行ESBL試驗：如果分離菌株ESBL試驗陽性，應(yīng)報告以上藥物為耐藥。對四環(huán)素敏感的菌株也被認為多西環(huán)素和米諾環(huán)素敏感。然而，對四環(huán)素中介或耐藥的某些菌株可以對多西環(huán)素或米諾環(huán)素或二者敏感。當(dāng)前第31頁\共有45頁\編于星期三\6點LOREMIPSUMDOLORESBL篩選陰性，但1-3代頭孢菌素類（R），β-內(nèi)酰氨酶抑制劑組成的復(fù)方制劑（R）：

提示該菌株可能為高產(chǎn)AmpC酶，此時對所有青霉素類、1-3代頭孢菌素類、氨曲南及頭霉素均耐藥。

可以選用碳青霉烯類（如亞胺培南、美洛培南）或四代頭孢（頭孢吡肟）。

易產(chǎn)生誘導(dǎo)型AmpC酶的菌株主要有：腸桿菌屬、沙雷菌屬、枸櫞酸桿菌屬。而高產(chǎn)AmpC酶的產(chǎn)生與抗生素誘導(dǎo)有關(guān)，三代頭孢、克拉維酸、亞胺培南均為強誘導(dǎo)劑。

藥物MIC(μg/ml)

敏感性AMP≥32RAMC≥32RTZP≥128RKZ≥64RCOX≥64RCTX≥64RFEP2SATM≥16RETP≤0.5SFM≥512R藥物MIC(μg/ml)

敏感性IPM≤1SAK16SGN

4STOB

4SCIP≥

4RLEV≥

8RTE2SSXT≤20SSPZ14(KB法）RESBL篩選-當(dāng)前第32頁\共有45頁\編于星期三\6點MRSA篩選解讀：頭孢西丁是被用于檢測mecA介導(dǎo)苯唑西林耐藥的替代品；根據(jù)頭孢西丁結(jié)果來報告苯唑西林敏感或耐藥。篩選陽性表示該菌存在mecA介導(dǎo)的苯唑西林耐藥，屬于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）。MRSA對當(dāng)前所有使用的b-內(nèi)酰胺類藥物均耐藥（除具有抗MRSA活性的新的頭孢菌素外，如：頭孢洛林）。值得注意的是：由于罕見非mecA介導(dǎo)的苯唑西林耐藥機制，即mecA陰性但苯唑西林MIC是耐藥（mecA≥4μg/ml）的菌株，應(yīng)報告苯唑西林耐藥。當(dāng)前第33頁\共有45頁\編于星期三\6點篩選高水平氨基糖苷類耐藥的腸球菌判斷聯(lián)合用藥方案：敏感：與作用于細胞壁合成，而且也是敏感的藥物（如氨芐西林、青霉素和萬古霉素）聯(lián)合時出現(xiàn)協(xié)同作用。耐藥：與作用于細胞壁合成的藥物聯(lián)合時無協(xié)同作用。當(dāng)前第34頁\共有45頁\編于星期三\6點臨床需了解的一些事：從腦脊液中分離的流感嗜血桿菌，常規(guī)只測試和報告：氨芐西林、一種三代頭孢菌素（多為頭孢曲松或頭孢噻肟）、氯霉素和美羅培南頭孢噻肟或頭孢曲松治療腦膜炎需用最大劑量為了在常見感染的膿腫和/或血供差的組織中達到最佳藥物濃度，治療厭氧菌感染推薦用最大抗菌藥物劑量。當(dāng)使用最大劑量，并進行適當(dāng)?shù)妮o助治療，如外科引流和清創(chuàng)術(shù)等，對厭氧菌感染的治療極其重要。由于大部分革蘭陽性微生物是b-內(nèi)酰胺酶陰性，因此，推薦青霉素和氨芐西林作為首選；但對于革蘭陰性微生物則否，由于大多產(chǎn)b-內(nèi)酰胺酶。當(dāng)前第35頁\共有45頁\編于星期三\6點（一）天然耐藥！例如：肺炎克雷伯菌對氨芐西林天然耐藥奇異變形桿菌對四環(huán)素類（包括替加環(huán)素）、呋喃妥因天然耐藥銅綠假單胞菌對復(fù)方磺胺天然耐藥陰溝腸桿菌對頭孢呋辛天然耐藥產(chǎn)單李斯特菌對氨曲南天然耐藥曲霉菌對氟康唑天然耐藥……等等當(dāng)前第36頁\共有45頁\編于星期三\6點腸桿菌科細菌的固有耐藥性當(dāng)前第37頁\共有45頁\編于星期三\6點葡萄球菌屬細菌固有耐藥性當(dāng)前第38頁\共有45頁\編于星期三\6點腸球菌屬細菌的固有耐藥性當(dāng)前第39頁\共有45頁\編于星期三\6點（二）藥敏試驗有局限性藥敏報告不是代表致病菌；藥敏標(biāo)準(zhǔn)的局限性；現(xiàn)在的藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)和療效判定的指標(biāo)不一致當(dāng)前第40頁\共有45頁\編于星期三\6點未找到真正的感染菌有菌部位標(biāo)本如痰、咽試子、前列腺液、糞便、尿液、陰試子等，標(biāo)本的采集很難不污染攜帶菌；無菌部位的標(biāo)本如血液和腦脊液，如培養(yǎng)出表皮葡萄或類白喉棒狀桿菌也有