浙江大學細胞工程第四章課件

4.1細胞融合4.2雜種細胞的遺傳特性和應(yīng)用4.3淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體技術(shù)當前第1頁\共有57頁\編于星期四\3點4.1細胞融合4.11聚乙二醇介導(dǎo)的細胞融合4.12細胞電融合4.13雜種細胞的篩選當前第2頁\共有57頁\編于星期四\3點當前第3頁\共有57頁\編于星期四\3點4.11聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的細胞融合

原理：PEG帶有大量的負電荷,和原生質(zhì)體表面的負電荷在鈣離子的連接下，形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著和結(jié)合，在高pH,高鈣離子的溶液的作用下，將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種原生質(zhì)體上的正負電荷連接起來，進而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。當前第4頁\共有57頁\編于星期四\3點當前第5頁\共有57頁\編于星期四\3點當前第6頁\共有57頁\編于星期四\3點雙向電泳：在交流電場的作用下（1MHz，150V/cm）細胞膜上正負電荷分離，產(chǎn)生偶極，兩個極化的細胞會發(fā)生相互的緊密接觸。當前第7頁\共有57頁\編于星期四\3點可逆電降解：在高頻電場的脈沖作用下（50ms，電場強度1.2－2kV/cm），細胞膜上的離子發(fā)生位移，而使電荷分開，細胞質(zhì)膜產(chǎn)生電勢，正、負電荷相互吸引，細胞膜變薄，隨細胞勢的增加，膜降解穿孔，形成微孔。電場誘發(fā)的微孔面積和數(shù)目與細胞膜總表面積相對不大時，微孔可以重新封閉。當前第8頁\共有57頁\編于星期四\3點電場示意圖當前第9頁\共有57頁\編于星期四\3點甜菜原生質(zhì)體電融合過程1）在高頻電流電場下的相互接觸。2）脈沖刺激后30s3)50秒后4）1.5分鐘后5）6分鐘后6）15分鐘后，原生質(zhì)體融合完成。當前第10頁\共有57頁\編于星期四\3點注意事項1）對介質(zhì)要求高，一般用高純度的蒸餾水并選用適當?shù)姆请娊橘|(zhì)溶液，如甘露醇等配制等滲性介質(zhì)。2）注意控制高頻交流電壓和直流脈沖電壓的強度和時間，以防止細胞連接成串或發(fā)生可逆性降解。當前第11頁\共有57頁\編于星期四\3點優(yōu)點：融合率高，達70％－80％，甚至100％融合率＝（融合組多核細胞的核數(shù)－對照組多核細胞的核數(shù)/對照組的全部細胞數(shù)）×100％可在顯微鏡下定向誘導(dǎo)細胞融合可直接挑選雜種細胞當前第12頁\共有57頁\編于星期四\3點4.13雜種細胞的篩選原理：兩種親本細胞融合的混合物中可能有多種類型細胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細胞。1）親本2）同核體：同源原生質(zhì)體的融合體3）異核體：非同源的原生質(zhì)體的融合體4）多核體：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體5）異胞質(zhì)體：具有不同胞質(zhì)來源的雜合細胞。6）核質(zhì)體：有細胞核而帶有少量細胞質(zhì)的亞原生質(zhì)體當前第13頁\共有57頁\編于星期四\3點植物細胞篩選方式1）遺傳互補篩選法：利用每一親本貢獻一個功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細胞表現(xiàn)正常。如親本1：葉綠體缺陷型親本2：光致死型兩親本在光照下一種死亡，另一種呈白色，融合細胞長成植株呈綠色，并能成長當前第14頁\共有57頁\編于星期四\3點2）抗性互補篩選法：利用親本細胞原生質(zhì)體對抗生素、除草劑及其它有毒物質(zhì)抗性差異選擇雜種細胞。如：親本1：對放線菌素D抗性，但在MS培養(yǎng)基上不能超過50個世代親本2：對放線菌素D很敏感，但能在MS上生長雜種細胞能在含有放線菌素的MS培養(yǎng)基上生長，而親本和其它細胞死亡當前第15頁\共有57頁\編于星期四\3點3）利用物理特性篩選法：根據(jù)親本的原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率、形成的愈傷組織的差異篩選雜種細胞。親本1：用異硫氰酸熒光素染色原生質(zhì)體親本2：葉肉細胞原生質(zhì)體在熒光顯微鏡下，親本1為紅色，親本2為綠色，雜種細胞可以區(qū)分當前第16頁\共有57頁\編于星期四\3點4）利用生長特性篩選法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細胞。例如粉蘭煙草與朗氏煙草細胞原生質(zhì)體均需外源激素才能生長，但其融合細胞可以產(chǎn)生內(nèi)源激素，在培養(yǎng)基上不需加激素。當前第17頁\共有57頁\編于星期四\3點動物細胞的篩選方式：1）利用抗藥性篩選系統(tǒng)：利用生物細胞對藥物敏感性差異篩選雜種細胞。親本A：對氨芐青霉素敏感，對卡娜霉素不敏感親本B：對卡娜霉素敏感，對氨芐青霉素不敏感雜種細胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基上生長當前第18頁\共有57頁\編于星期四\3點2）營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)：細胞在缺乏一種或幾種營養(yǎng)成分時，不能生長繁殖，即營養(yǎng)缺陷型細胞。利用兩種親本細胞營養(yǎng)互補作用原理可以篩選雜種細胞。親本A：色氨酸缺陷型親本B：蘇氨酸缺陷型雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細胞均會死亡。當前第19頁\共有57頁\編于星期四\3點3）溫度敏感突變型雜種細胞的篩選：一般的培養(yǎng)細胞能在32度到40度的范圍內(nèi)生長，但溫度敏感突變型的細胞能在高溫或低溫下生長。由此篩選雜種細胞。親本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生長。親本二：高溫敏感突變型，但不能抗卡娜霉素。雜種細胞能在高溫和含卡娜霉素的培養(yǎng)基上生長。當前第20頁\共有57頁\編于星期四\3點4.2雜種細胞的遺傳特性和應(yīng)用4.21雜種細胞在細胞生物學研究中的應(yīng)用4.23雜種細胞在植物育種中的應(yīng)用當前第21頁\共有57頁\編于星期四\3點4.21雜種細胞在細胞生物學研究中的應(yīng)用1）基因定位不同種屬的細胞融合時，常會出現(xiàn)一個親本細胞的染色體被優(yōu)先排除，而另一個親本的染色體被選擇性留下，即染色體分離的現(xiàn)象。由此，可根據(jù)表型和與表型特征相對應(yīng)的基因在特定染色體上。例如：HGPRT－人細胞與TK－的小鼠細胞融合后，可用HAT培養(yǎng)基分離得到一種僅含一條人E組染色體的雜種細胞，具有TK活性，由此得到人的TK基因是在E組染色體上的。當前第22頁\共有57頁\編于星期四\3點2）體細胞雜種的致瘤性分析通過正常二倍體細胞和致瘤性或病毒轉(zhuǎn)化細胞的融合來進行致瘤性的遺傳分析。3）遺傳缺陷的基因互補基于雜種細胞的基因互補作用，可分為基因間和基因內(nèi)的互補作用，即雜種細胞可以具有兩種親本在遺傳上缺陷的基因表型。通過這種基因互補，可以用正?；騺碇委熡捎诨蛲蛔兓蚧蛉笔У募膊?。當前第23頁\共有57頁\編于星期四\3點4）分化功能表達調(diào)控的研究通過細胞融合可將不同分化狀態(tài)或組織類型的細胞構(gòu)建成為能夠存活的種內(nèi)或種間雜種，同時對雜種細胞內(nèi)的基因組和胞質(zhì)觀察和分析，了解如何通過相互作用而最終導(dǎo)致原先表達的分化性狀熄滅或保留。當前第24頁\共有57頁\編于星期四\3點4.22雜種細胞在植物育種中的應(yīng)用雜種細胞是一條新的育種途徑，可以產(chǎn)生新經(jīng)濟性狀的良種。科學家已經(jīng)在禾本科、茄科、豆科、十字花科等植物中得到了雜種再生植株。一些近親植物、有性不親和的組合，如馬鈴薯×番茄等都得到了再生植株。目標：地上和地下部兼用種、固氮禾等具有兩種不同優(yōu)勢性狀的新品種。當前第25頁\共有57頁\編于星期四\3點4.3單克隆抗體4.31抗體的結(jié)構(gòu)與功能4.32單克隆抗體的制備和生產(chǎn)4.34單克隆抗體的改造和應(yīng)用當前第26頁\共有57頁\編于星期四\3點4.31抗體的結(jié)構(gòu)與功能當前第27頁\共有57頁\編于星期四\3點當前第28頁\共有57頁\編于星期四\3點抗體是由B細胞受抗原刺激后所分泌的蛋白質(zhì)?？贵w分子：由四條肽鏈所組成，兩條重鏈（H鏈）兩條輕鏈（L鏈）。結(jié)合區(qū)：抗體分子上有兩個抗原結(jié)合區(qū)可變區(qū)（V區(qū)）穩(wěn)定區(qū)（C區(qū)）當前第29頁\共有57頁\編于星期四\3點人體內(nèi)的五種抗體當前第30頁\共有57頁\編于星期四\3點4.32單克隆抗體的制備單克隆抗體(monoclonalantibody，簡稱McAb)：將能夠產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞和具有無限增殖力的骨髓瘤細胞融合在一起，形成雜交瘤細胞。雜交瘤細胞既能在體外快速生長，又能持續(xù)分泌成分單一的特異性抗體。這種單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體。當前第31頁\共有57頁\編于星期四\3點單抗的制備過程動物免疫與親本細胞的選擇細胞融合：淋巴細胞雜交瘤的制備雜交瘤細胞的篩選：有限稀釋法等單克隆抗體的制備和凍存單克隆抗體的純化當前第32頁\共有57頁\編于星期四\3點親本細胞的選擇骨髓瘤細胞：一般不分泌抗體，能在體外無限繁殖和連續(xù)繼代培養(yǎng)，且為HPRT－或TK－。多用BALB/C小鼠的骨髓瘤細胞。當前第33頁\共有57頁\編于星期四\3點淋巴細胞：經(jīng)過免疫處理的淋巴細胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：體內(nèi)法或體外法。體內(nèi)法：對細胞或微生物抗原可直接注射如小鼠體內(nèi)，可溶性蛋白抗原可與等量的福氏完全佐劑混合乳化后，注入到動物體內(nèi)。3－4天后，在無菌條件下可以取出脾或淋巴結(jié)制成懸液，存活率在95％以上的可以用于融合。體外法：直接提取大、小鼠淋巴細胞，調(diào)整為107個/ml，加適當濃度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴細胞。

當前第34頁\共有57頁\編于星期四\3點細胞融合將免疫脾細胞和小鼠骨髓細胞以2：1或10：1的比例混勻于50ml錐形離心管內(nèi)，1200rpm離心7—10分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細胞鋪展成薄層，在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內(nèi)逐滴加入50%的PEG0.5ml，隨后靜置90秒，再于5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴加入5－10ml不含血清的培液或鹽水緩沖液，以終止PEG的作用，再靜置10分鐘。當前第35頁\共有57頁\編于星期四\3點HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞細胞團塊分散后，加HAT溶液，稀釋至骨髓瘤細胞不超過2×105ml，即可加入有飼養(yǎng)細胞的96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；總量分別為0.2ml和1ml。用HAT選擇性培養(yǎng)時每隔2－3天半量換液，7天后可以選擇出雜交瘤細胞。當前第36頁\共有57頁\編于星期四\3點細胞融合的選擇示意圖當前第37頁\共有57頁\編于星期四\3點HAT選擇系統(tǒng)HAT是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細胞DNA合成有關(guān)。DNA合成途徑有兩種。當前第38頁\共有57頁\編于星期四\3點雜交瘤技術(shù)中，常選用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤細胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細胞為親本之一。HPRT-細胞的嘌呤只能由全合成途徑產(chǎn)生；TK-細胞的嘧啶只能由全合成途徑合成。含氨基喋呤培養(yǎng)基抑制了細胞內(nèi)嘌呤和嘧啶的全合成途徑。當前第39頁\共有57頁\編于星期四\3點嘌呤合成通路的阻斷當前第40頁\共有57頁\編于星期四\3點淋巴細胞具有合成DNA的兩條途徑。雜種細胞通過互補作用獲得HRPT或TK基因，可應(yīng)用培養(yǎng)基中次黃嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通過補救合成途徑合成DNA。在HAT培養(yǎng)基中，HPRT-或TK-親本細胞死亡，淋巴細胞亦逐漸死亡，只有雜種細胞存活。當前第41頁\共有57頁\編于星期四\3點特異性雜交瘤細胞的篩選通過選擇性培養(yǎng)后生長的雜交瘤細胞，僅有部分是分泌預(yù)定特異性抗體的雜交瘤細胞?？扇∩锨逡?，根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體類型及所需靈敏度等具體情況來加以選擇?？扇苄钥乖刹捎梅派涿庖?、免疫酶標測定、間接血凝等方法測定。細胞抗原可采用免疫熒光、51Cr釋放試驗、溶血空斑測定、補體依賴的細胞毒等方法直接測定針對這些抗原的抗體。當前第42頁\共有57頁\編于星期四\3點利用培養(yǎng)基對單抗進行鑒定的過程當前第43頁\共有57頁\編于星期四\3點雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)利用單個細胞培養(yǎng)技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的細胞系。在培養(yǎng)過程中，一般要加能釋放某些生長因子促進雜交瘤生長的飼養(yǎng)細胞，如小鼠的腹腔巨噬細胞、脾細胞或胸腺細胞等。方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、應(yīng)用熒光激活分選儀等。當前第44頁\共有57頁\編于星期四\3點有限稀釋法通過適當?shù)南♂屵_到分離單個細胞進行培養(yǎng)的目的1）取出陽性孔內(nèi)的細胞進行計數(shù)2）用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個細胞。3）如果在96孔板內(nèi)每孔加0.1ml，其機率將為每孔內(nèi)落入一個細胞。4）加入一定數(shù)量的飼養(yǎng)細胞，經(jīng)過8~12天后，可觀察到有集落生長的孔。5）根據(jù)檢測的陽性結(jié)果再次進行克隆化。當前第45頁\共有57頁\編于星期四\3點軟瓊脂培養(yǎng)法在加入飼養(yǎng)細胞的無菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5％的瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細胞的0.25％的軟瓊脂。待細胞長成集落后，用毛細管吸出移種于含飼養(yǎng)細胞的96孔板內(nèi)。當前第46頁\共有57頁\編于星期四\3點單抗的大規(guī)模生產(chǎn)1）誘生腹水將穩(wěn)定分泌單抗的細胞株，通過擴大培養(yǎng)，接種于Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔內(nèi)增殖，從而得到大量含單抗的腹水。方法是將降植烷或石蠟油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接種3~5×106雜交瘤細胞。10~20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中約含1~10mg單抗。2）利用微載體、微囊、旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)等進行大規(guī)模培養(yǎng)。當前第47頁\共有57頁\編于星期四\3點4.33單克隆抗體的改造和應(yīng)用單抗作為體內(nèi)體外診斷試劑在臨床生化診斷、病理組織定位、體內(nèi)腫瘤的定位等單克隆抗體靶向制劑，治療癌癥等疾病雜交人－鼠單克隆抗體當前第48頁\共有57頁\編于星期四\3點單抗作為體內(nèi)體外診斷試劑現(xiàn)在已經(jīng)有各種不同類型的單抗試劑合在市場出售，例如乙型肝炎的表面抗原，鐵蛋白、促絨毛膜性激素、促甲狀腺激素、癌癥、艾滋病等診斷試劑。用同位素標記的單抗在特定的組織中成象的技術(shù)可以用于腫瘤、心血管畸形的體內(nèi)診斷。當前第49頁\共有57頁\編于星期四\3點1、單克隆抗體靶向制劑1）藥物與單抗直接偶聯(lián)通過化學反應(yīng)使藥物分子的氨基與抗體分子的羧基之間直接形成穩(wěn)定的酰胺鍵。利用氧化劑把藥物分子上的糖基氧化成羰基。利用羰基與抗體分子的氨基反應(yīng)形成西佛氏堿，最后還原。這樣的靶向制劑保留一定的藥物活性，并具有一定的選擇性。如：1，4－溴柔紅霉素與腫瘤細胞單抗形成的偶合物，對腫瘤有明顯的選擇性毒性。當前第50頁\共有57頁\編于星期四\3點2）藥物通過小分子與單抗連接通過一些小分子交聯(lián)劑，把藥物分子上的某些基團連接起來。小分子交聯(lián)劑：如同型雙功能試劑，包括戊二醛、順烏頭酸酐、馬來酸酐、戊二酐；異型雙功能試劑：N－琥珀酰胺基－3－丙酸和寡肽等。