沙眼衣原體感染與精子凋亡關系的初探

沙眼衣原體感染與精子凋亡關系的初探【摘要】目的：探討精液沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis,CT)感染與精子凋亡的關系，為研究男性不育提供新思路。方法：沙眼衣原體的檢測用免疫層析法，采用瑞－姬染色精子，觀察精子形態(tài)變化；用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧核苷酸原位末端標記法檢測凋亡精子。結果：精液CT陽性組精子凋亡率％，正常對照組精子凋亡率為％，組間差異顯著。結論：精液CT感染導致精子凋亡率增加，CT感染可能是男性不育的重要原因之一。

【關鍵詞】精子；衣原體,沙眼；細胞凋亡；不育，男性

［Abstract］Objective:ToinvestigatedtherelationshipofChlamydiatrachomatis(CT)infectionwithspermapoptosisthatmightrelatewithmalesterility.Method:ImmunochromatographymethodwasusedtodetectChlamydiatrachomatis;Conventionalcellmorphologystaining(wrightgimsastaining),andterminaldeoxynucleotidyltransferaseenzyme(TdT)mediateddeoxynucleotidylinsituandlabeling(TUNEL)wereadoptedforapoptosisdetection.Results:Spermapoptosisrateswere±%and±%inCTinfectiongroupandnormalfertilitygrouprespectively;Therewasdramaticallydifferencebetweenthetwogroups(),whichshowedthattheCTinfectionofsemencausedincreaseofspermapoptoticrates.Conclusions:CTinfectionmightbeoneofthemostimportantcausesformaleinfertility.

［Keywords］spermatozoa;chlamydiatrachomatis;apoptosis;infertility,male

男性生殖道的感染是引起男性不育的重要的因素，在癥狀或非癥狀男性生殖道感染中，起關鍵作用的兩種生物體是解脲支原體(mycoplasmaurealytium;MU)和沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis;CT)。近年來，關于MU感染與男性不育的關系已有大量的報道，但CT感染對精子及男性不育的影響報道不多[1～3]，CT感染引起男性不育的機制仍不清楚。據(jù)WHO報道，每年全球約5億人新發(fā)性傳播疾病，其中的18％是由CT感染造成[4，5]。在女性中，年輕、性活躍者是生殖道CT感染的好發(fā)人群，在CT的傳播中具有重要作用；在男性中，泌尿生殖道CT感染率不易確定，其原因是CT感染不易作微生物學檢查或為無癥狀者。細胞凋亡是細胞在胞外或胞內(nèi)信號誘導下發(fā)生的主動自殺死亡過程，是調(diào)控機體發(fā)育、維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、由基因控制的細胞主動死亡過程。關于精子凋亡與男性不育的關系已有報道。為明確CT感染引起男性不育的機制，于2007年對精液CT感染與精子凋亡之間的關系進行了探索。

1材料與方法

研究對象

正常對照組15例，有正常生育史，身體健康，精液CT檢測陰性，精液常規(guī)正常的自愿捐精子者；年齡24～32歲，平均歲。CT陽性組57例，不育門診就診者，為婚后同居2年以上，有正常性生活，未采用任何避孕措施，睪丸、附睪、內(nèi)分泌、染色體等檢查無異常；精液CT檢測陽性，年齡24～40歲，平均歲，不育年限2～10年，平均年，其配偶檢查無異常。

試劑

TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒由南京凱基生物技術有限公司提供，CT快速免疫檢測試劑盒由英國Unipath公司提供，1×Earle’s和10×Earle’s液由Sigma公司提供，percoll原液由南京凱基生物技術有限公司提供，TritonX100由北京拜爾迪生物公司提供。

研究方法

所有研究對象均禁欲3～5d，手淫法收集全程精液于無菌玻璃容器中，置于35℃恒溫恒濕箱中液化。取液化后的精液2ml加入底部有2ml45%Percoll液的離心管中，2000r/min離心10min，精液細胞主要沉積于精漿和45％Percoll液之間，于精漿與45％Percoll液之間用移液器取50μl×5次精液沉淀入另一組離心管中，加入2ml生理鹽水，充分混勻；1500r/min離心10min棄上清液，加入生理鹽水2ml；充分混勻后，1500r/min離心10min，棄上清液，加入生理鹽水2ml；充分混勻后，1500r/min，離心10min棄上清液，加入3ml生理鹽水，充分混勻，配成一定濃度的細胞懸液。取制備好的精液細胞懸液50μl分別滴加在普通潔凈的玻片和多聚賴氨酸防脫玻片上，用采血針推平，棄去多余的細胞懸液，平放、自然涼干。

CT檢測

取液化后的精液1～2ml，1500r/min離心10min，取沉淀，按照試劑盒說明書進行操作。

常規(guī)形態(tài)學染色

取制備好的普通玻片精液細胞樣本，浸入瑞－姬染液中1min，倒入等量的PBS緩沖液，再染10min，自來水沖洗，自然涼干后用光學樹脂封片，置油鏡下檢查并拍照。

TdT介導的TUNEL法檢測凋亡精子

取已制備好的多聚賴氨酸防脫玻片精液細胞樣本浸入固定液，室溫15～25℃固定15min～1h；-20℃的乙醇中放置2h；PBS漂洗3次，每次5min；浸入封閉液，室溫15～25℃封閉10min；PBS漂洗3次，每次5min；浸入通透液中，冰上促滲2min。PBS漂洗兩次，樣本周圍用吸水紙吸干；每個樣本滴加50μlTdT酶反應液，加蓋玻片37℃避光濕潤反應60min；PBS漂洗3次，樣本周圍用吸水紙吸干；滴加50μlStreptavidinHRP工作液，加蓋玻片37℃濕潤避光反應30min；PBS漂洗3次；滴加50μlDAB工作液，室溫顯色反應10min；PBS漂洗3次，光學顯微鏡下檢測及拍照。

統(tǒng)計學處理

采用SPSS統(tǒng)計軟件包進行χ2檢驗，結果用表示。

2結果

精子周亡率

觀察精子頭尾部，計數(shù)凋亡精子，統(tǒng)計凋亡率，正常對照組精子凋亡率為％，CT陽性組精子凋亡率達到％。

TdT介導的TUNEL法檢查凋亡精子

隨機觀察正常對照組和CT陽性組精液標本，凋亡精子頭部呈棕黃色，核邊集、呈新月狀或塊狀小體。

3討論

CT是一類專性細胞內(nèi)生長、有獨特發(fā)育周期的原核細胞型微生物，很少從正常男性尿道中分離出來，但被認為是非淋菌性尿道炎、附睪炎和慢性前列腺炎的主要病因之一，其對男性生育功能的影響已引起了人們的關注。研究結果顯示，CT陽性組和正常對照組精子凋亡率分別為％和％，組間差異顯著，表明精液CT感染導致精子凋亡率增加。CT感染可刺激巨噬細胞分泌IL1、LI6及TNFα等細胞因子[7，8]，而TNFα是啟動細胞凋亡的重要細胞因子；同時，TNFα增高后使轉移單電子的還原型輔圖1CT陽性組少精子組。過量的ROS，一方面可使精子線粒體內(nèi)、外膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，使膜的脂質(zhì)排列松散，內(nèi)膜脊減少，ATP合成降低；另一方面過量ROS還可引起精子核的DNA發(fā)生斷裂，導致精子凋亡的增加。Darville等研究小鼠生殖道抗CT感染機制，發(fā)現(xiàn)在抗CT感染的宿主免疫應答中存在細胞介導免疫。Spadafora[10]研究證實生精細胞通過CD4分子介導免疫后，具有自發(fā)攝取外源性DNA能力，精子與外源性DNA相互作用，刺激內(nèi)源性核酸導致類似凋亡的細胞死亡過程。

細胞凋亡(apoptosis)是多細胞生物普遍存在的細胞死亡形式之一。有研究顯示，在生長發(fā)育、組織代謝和一些疾病等許多生理和病理過程中，凋亡都發(fā)揮著極為重要的作用。目前檢測凋亡的方法很多,其中原位末端標記技術TUNEL法是分子生物學與形態(tài)學相結合的研究方法,可對完整的單個凋亡細胞或凋亡小體進行原位染色,能準確反映細胞凋亡最典型的生物化學和形態(tài)特征。DNA裂解為許多單或寡核苷酸片斷是細胞凋亡的主要生化標志。由于正常的、或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，故很少能夠被染色[11]。應用TdT介導的TUNEL法檢測正常對照組和CT陽性組精液標本，凋亡精子呈棕黃色，而未凋亡精子不著色。在應用TdT介導的TUNEL法檢測凋亡精子的同時，應用常規(guī)瑞－姬氏染色法從另一角度檢測凋亡精子，發(fā)現(xiàn)凋亡精子核染色質(zhì)固縮并核周聚集，呈境界分明的新月形或塊狀小體；胞質(zhì)起泡，胞質(zhì)嗜酸性增強等形態(tài)結構改變，與熊承良等[12]報道一致。萬長春等[13]研究表明，由于常規(guī)形態(tài)學方法不能早期發(fā)現(xiàn)凋亡細胞核與細胞器的改變,故凋亡細胞百分率常規(guī)形態(tài)學染色法低于TUNEL法,但二者差異不顯著()。

研究表明，精液CT感染導致了精子凋亡率增加，CT感染可能是導致男性不育的重要原因之一。

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