掃描電鏡樣品制備

掃描電鏡樣品制備演示文稿當(dāng)前第1頁\共有14頁\編于星期四\0點優(yōu)選掃描電鏡樣品制備當(dāng)前第2頁\共有14頁\編于星期四\0點掃描電鏡即掃描電子顯微鏡（ScanningElectronMicroscope，簡稱SEM）。主要用于觀察樣品的表面形貌、割裂面結(jié)構(gòu)、管腔內(nèi)表面的結(jié)構(gòu)等。當(dāng)前第3頁\共有14頁\編于星期四\0點一、掃描電鏡工作原理：主要是利用樣品表面產(chǎn)生的二次電子成像來對物質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)進行研究，是探索微觀世界的有力工具。主要優(yōu)點：景深長，所獲得的圖像立體感強，可用來觀察生物樣品的各種形貌特征。當(dāng)前第4頁\共有14頁\編于星期四\0點二、實驗用品材料植物的的根、莖、葉或動物的臟器等。2.試劑丙酮、乙醇、2％戊二醛溶液、1％鋨酸、0.1mol/LPH7.2磷酸緩沖液、醋酸異戊酯、液體二氧化碳、導(dǎo)電膠等。3.器材掃描電鏡、

臨界點干燥法、真空噴鍍儀、青霉素小瓶、培養(yǎng)皿、載玻片、牙簽、脫脂棉等。當(dāng)前第5頁\共有14頁\編于星期四\0點三、掃描電鏡樣品的制備●當(dāng)前第6頁\共有14頁\編于星期四\0點取樣：將取下的動植物組織放入預(yù)冷的含有2％戊二醛溶液的載玻片上，用刀片將組織塊切成長4mm左右、高3mm左右的小塊。2.樣品的清潔：把載玻片上切好的樣品快，用牙簽輕輕地逐個撥入盛有0.1mol/LPH7.2磷酸緩沖液的青霉素小瓶中漂洗，并反復(fù)更換用于清洗的緩沖液，一般漂洗1小時，換液3-4次。當(dāng)前第7頁\共有14頁\編于星期四\0點3.樣品的固定樣品的固定、漂洗和脫水等處理所用的試劑和方法基本上與透射電鏡的樣品相同，但由于掃描電鏡觀察的是樣品的表面，主要是要求保持樣品表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脫水過程也與透射電鏡樣品處理有不同之處。一般在4℃的條件下完成固定比較好，戊二醛、鋨酸均可單獨固定，也可用“戊二醛-鋨酸”雙重固定法。固定1-3小時（依樣品種類和固定劑而已）后，吸出固定液，加入0.1mol/LPH7.2磷酸緩沖液，漂洗1小時，換液3-4次。當(dāng)前第8頁\共有14頁\編于星期四\0點4.脫水從小瓶中吸出緩沖液，加入乙醇逐級梯度脫水，脫水劑的乙醇濃度依次為30%－50%－70%－80%－90%－100%乙醇（兩次）逐級脫水；樣品在每級停留15-30分鐘。5.置換乙醇吸出乙醇，加入醋酸異戊酯與乙醇1：1的混合液，浸泡10-20分鐘并適當(dāng)搖動，再吸棄混合液，加入純醋酸異戊酯浸泡10-20分鐘并適當(dāng)搖動。6.樣品的干燥常規(guī)臨界點干燥法。當(dāng)前第9頁\共有14頁\編于星期四\0點臨界點干燥法

臨界點干燥法是一種消除了物相界面(液相／氣相)，也就是消除了表面張力來源的干燥方法。這種方法由于沒有表面張力的影響，所以樣品不易收縮和損傷。具體處理步驟如下：裝樣：將樣品從醋酸異戊酯中挑入(或倒入)樣品籠中，用濾紙吸去樣品籠外圍的醋酸異戊酯，然后連籠移入儀器的樣品杯(高壓容器)內(nèi)，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。(注：在裝樣前，應(yīng)先打開儀器電源，將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在0℃處預(yù)冷10～15min，以保證液態(tài)二氧化碳有足夠量進入樣品杯中)。注入液體二氧化碳依次打開二氧化碳鋼瓶排氣閥和儀器的進氣閥在0～10℃下，向樣品杯注入液體二氧化碳。當(dāng)液體二氧化碳充至樣品杯容積的50％(通過刻度尺觀察，以液面超過樣品籠為度)時，關(guān)閉儀器進氣閥，靜置15～20min，讓醋酸異戊酯向液態(tài)二氧化碳中充分?jǐn)U散，然后，打開儀器排氣流量計閥門和進氣閥門，讓其邊排氣邊充液10min左右，(讓含有醋酸異戊酯的二氧化碳排出和充入新鮮的液態(tài)二氧化碳)再關(guān)閉排氣閥；繼續(xù)充入液體二氧化碳至樣品杯的80％左右，關(guān)閉進液閥，停止充液。當(dāng)前第10頁\共有14頁\編于星期四\0點加溫置換：將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在20℃處經(jīng)15～20min后，由于溫度升高，杯內(nèi)液體二氧化碳逐漸氣化，因此，壓力也隨之上升至7000Pa左右，樣品中的醋酸異戊酯將與二氧化碳充分置換。氣化：將溫度旋鈕調(diào)至臨界溫度以上(35～40℃)，此時隨著溫度升高，樣品杯內(nèi)的壓力也逐漸增加，達到二氧化碳的臨介點，界面也隨之消失。當(dāng)壓力達到7134Pa時，經(jīng)5min后，即可排氣。排氣：在保持溫度不變的條件下(即不關(guān)電源)，打開流量計的排氣閥門，以1.0～1.51／min的速度排氣(速度慢些更好)。約經(jīng)45～60min后，排氣完畢，樣品杯的壓力下降到零，將溫度調(diào)節(jié)至室溫約5rain后，即可取出樣品裝臺鍍膜(若不能立即裝臺，應(yīng)置于干燥器內(nèi)保存)。當(dāng)前第11頁\共有14頁\編于星期四\0點臨界點干燥操作時的注意事項：

在樣品放進樣品杯前，樣品杯應(yīng)預(yù)先冷卻至0～10℃。樣品不宜過濕，但也不能讓其表面干涸，應(yīng)在半干半濕時送入樣品杯。因為過濕表明乙酸異戊脂太多會干燥后樣品仍含有乙酸異戊脂，影響干燥效果。而過干又會因空氣干燥而造成樣品己變形，再進行臨介點干燥也沒有意義了。一次加入的樣品不宜過多，以免帶進過多的中間液，使樣品干燥不完全，另外，樣品過多使二氧化碳量充入不足而達不到臨界點。充入液體二氧化碳的量要足。因為充液量不足，達不到臨界值，起不到臨界點干燥作用，一般充液量應(yīng)達樣品杯容積的2/3左右。在加溫氣化時，實際操作溫度應(yīng)超過臨界值，以保證達到充分的臨界狀態(tài)。"開"、"閉"閥門時，動作要輕緩，盡量防止二氧化碳液對樣品產(chǎn)生突然沖擊而造成樣品損傷。因此，樣品籠的上下應(yīng)墊上一層鏡頭紙或濾紙。排氣速度也應(yīng)盡量緩慢，一般放氣時間應(yīng)在．4Omin以上，有時也可以放氣過夜或過中午。當(dāng)前第12頁\共有14頁\編于星期四\0點7.粘貼樣品用牙簽將少量導(dǎo)電膠涂到樣品臺上，膠面應(yīng)略小于樣品底面。用鑷子輕夾樣品側(cè)面，保證觀察面向上貼牢在涂膠上。粘貼后，待導(dǎo)電膠干透，才能進行真空鍍膜和SEM鏡檢。8.樣品的導(dǎo)電處理生物樣品和其他非金屬樣品的表面電阻率很高，在電鏡觀察時，往往容易發(fā)生荷電現(xiàn)象。另外，生物樣品都是由低原子序數(shù)的碳、氫、氧、氮等元素組成，二次電子的發(fā)射率很低，信號弱，難以獲得必要的圖像反差。因此，為了消除或減少以上不良現(xiàn)象的產(chǎn)生，生物樣品和非導(dǎo)電的樣品在掃描電鏡觀察前，均需進行表面導(dǎo)電處理。掃描電鍍樣品的表面導(dǎo)電處理方法，主要有金屬鍍膜法和組織導(dǎo)電處理法兩種。其中金屬鍍膜法又有真空鍍膜及離子濺射鍍膜法等方法，本實驗采用離子濺射鍍膜法進行鍍膜。

當(dāng)前第13頁\共有14頁\編于星期四\0點離子濺射鍍膜法:

在低真空中進行輝光放電時，由于離子沖擊，陰極金屬物質(zhì)有飛濺現(xiàn)象稱為濺射。利用離子濺射儀對樣品進行金屬鍍膜的方法，稱為濺射鍍膜法。濺射鍍膜法的裝置很簡單，主要由真空部分(真空泵)和濺射部分(真空罩)組成，在真空罩內(nèi)裝有陰極和陽極，陰極對著陽極的一面裝有用于濺射用的金屬靶(黃金靶、鉑靶、白金靶或鈀靶等)，樣品放在陽極的樣品座上面。