淺論RNAi沉默PRL1基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞侵襲能力的影響

淺論RNAi沉默PRL1基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞侵襲能力的影響【摘要】目的：探討RNA干擾(RNAinterference，RNAi)沉默促肝細(xì)胞再生磷酸酶1(phosphataseofregeneratinglivercell1，PRL1)基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞侵襲力的影響。方法：應(yīng)用PRL1基因小干擾RNA轉(zhuǎn)染處理肺癌A549細(xì)胞后，分別采用實(shí)時(shí)定量RTPCR和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)PRL1基因mRNA和蛋白水平，分別采用軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗(yàn)和Boyden小室模型試驗(yàn)檢測(cè)癌細(xì)胞的錨著不依賴性增殖和侵襲能力。結(jié)果：與對(duì)照組比較，siRNA轉(zhuǎn)染組PRL1mRNA和蛋白水平明顯下調(diào)，且呈濃度和時(shí)間依賴性。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PRL1siRNA可有效抑制肺癌細(xì)胞集落生長(zhǎng)和侵襲能力，且與濃度相關(guān)。結(jié)論：PRL1基因在肺癌侵襲中起著重要的作用，采用PRL1siRNA轉(zhuǎn)染可抑制肺癌細(xì)胞侵襲。

【關(guān)鍵詞】肺腫瘤；促肝細(xì)胞再生磷酸酶1；侵襲；RNA干擾；小干擾RNA

［Abstract］Objective:Tostudytheeffectsandmechanismofphosphataseofregeneratinglivercell1smallinterferingRNAoninvasionofhumanlungcancer：AfterlungcancercelllineA549weretransfectedbyPRL1siRNA,themRNAandproteinofPRL1weredeterminedbyrealtimeRTPCRandwesternblotassay,anchorageindependentgrowthwasexminedbyclonformationinsoftagar,andinvasionabilitywasevaluatedbyboydenchambermodel.Results：ThesiRNAcoulddownregulatethelevelofmRNAandproteinofPRL1inadoseandtimedependentmanner.SuppressionofofPRL1expressioncaninhibitinvasionabilityandanchorageindependentgrowthindosedependentmanners.Conclusion：PRL1genemightplayanimportantroleindevelopmentofhumanlungcancer,anddownregulationbyPRL1siRNAcouldinhibitinvasionofhumanlungcancercell.

［Keywords］lungcarcinoma；phosphataseofregeneratinglivercell1；invasion；RNAinterference；smallinterferingRNA

蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosinephosphatase,PTP)在蛋白磷酸化和去磷酸化平衡中起著重要的作用。促肝再生磷酸酶(phosphataseofregeneratingliver,PRLs)是PTP酶家族重要成員之一，該基因家族包括PRL1，PRL2，PRL3三個(gè)成員,它們分別定位在6q12,1p35,染色體上,彼此之間的同源性高達(dá)76%～85%［1，2］。

許多實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PRLs分子能導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化并且增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、移動(dòng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力［3-10］。但目前對(duì)PRL1基因在肺癌細(xì)胞侵襲中的研究甚少。本研究借助于RNA干擾技術(shù)，以合成的PRL1基因小干擾RNA轉(zhuǎn)染處理肺癌A549細(xì)胞，觀察了PRL1siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)癌細(xì)胞侵襲力的影響。

1材料與方法

材料

人肺癌A549細(xì)胞，購(gòu)自上海生命科學(xué)院。PRL1siRNA序列，由美國(guó)Dharmacon公司合成。PRL1抗體購(gòu)自SantaCruz公司。Trizol，RNase抑制劑，逆轉(zhuǎn)錄酶SSRTⅡ，Taq酶和轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

方法

細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染處理

肺癌A549細(xì)胞在含10％胎牛血清的RBMI1640培養(yǎng)液、37℃、5％CO2、飽和濕度環(huán)境的條件下連續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天，將×105對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，1ml/孔，培養(yǎng)過(guò)夜。次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染?；静僮靼凑f(shuō)明書進(jìn)行。細(xì)胞分組：空白對(duì)照組：未經(jīng)任何處理的肺癌細(xì)胞；空載對(duì)照組：即脂質(zhì)體對(duì)照組；錯(cuò)配對(duì)照組；siRNA組：10％胎牛血清的RBMI1640中含不同濃度的已用脂質(zhì)體包埋的siRNA。轉(zhuǎn)染后于不同時(shí)間采用胰酶消化收取細(xì)胞，進(jìn)行以下試驗(yàn)。

肺癌細(xì)胞PRL1基因檢測(cè)

mRNA水平

采用熒光實(shí)時(shí)定量RTPCR檢測(cè)。收集細(xì)胞，以Trizol抽提細(xì)胞總RNA,取總RNA1μg，以O(shè)ligodT為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以此cDNA鏈2μl為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行。PRL1定量PCR引物：上游5′ATGGCTCGAATGAACCGCCCAG3′；下游5′TTATTGAATGCAACAGTTGTTT3′。以3磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件為：95℃，預(yù)變性3min，95℃，30s；52℃，45s；72℃，45s。35個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸7min。

蛋白水平

采用蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)。提取對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后進(jìn)行常規(guī)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。利用KodakDigitalScience1DImageAnalysisSoftware(圖1，圖2）。

PLR1siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)癌細(xì)胞軟瓊脂集落形成的影響

軟瓊脂集落形成試驗(yàn)結(jié)果顯示，肺癌A549細(xì)胞在體外半固體培養(yǎng)體系中可以自發(fā)地形成集落，而經(jīng)PRL1siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞集落生長(zhǎng)呈劑量依賴性減少(）。

PRL1siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲的影響

Boyden小室上室細(xì)胞穿過(guò)膜上matrigel到膜的下室面，其數(shù)量反映了細(xì)胞侵襲能力的大小。收集轉(zhuǎn)染48h的細(xì)胞，采用Boyden小室模型檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，siRNA組穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯下降，且與濃度相關(guān)(）。

3討論

RNAi是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)mRNA的生物學(xué)現(xiàn)象，能使基因的mRNA被相應(yīng)的雙鏈RNA分子剔除，其效果要遠(yuǎn)強(qiáng)于正義和反義RNA［13］。RNAi最主要的功能在于可以調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種高級(jí)生命活動(dòng)。而siRNA是指RNAi過(guò)程中在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的長(zhǎng)約21～25核苷酸(nt)的小雙鏈RNA分子，是RNAi作用機(jī)制的重要中間效應(yīng)分子。而且已有人工化學(xué)合成的siRNA，具有明顯的剔除相應(yīng)基因mRNA的效果［10,13-16］。由于siRNA具有高效剔除基因表達(dá)的工具，已被廣大科學(xué)工作者用作研究基因功能和基因治療的工具。

在PRLs家族中，PRL1是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的基因，它是在鼠的3T3成纖維細(xì)胞中作為肝再生早期反應(yīng)的基因被發(fā)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了PRL1的小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)［3］，提示PRL1基因可促進(jìn)某些癌細(xì)胞增殖。但PRL1在肺癌細(xì)胞中作用尚不清楚。

為了解PRL1基因在肺癌細(xì)胞侵襲中的作用，本研究根據(jù)PRL1基因mRNA特點(diǎn)，設(shè)計(jì)siRNA序列，并用化學(xué)方法合成siRNA，轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞后，分別采用熒光實(shí)時(shí)定量RTPCR和蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)PRL1基因mRNA和蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞PRL1基因mRNA和蛋白水平明顯下降，提示PRL1siRNA轉(zhuǎn)染成功。

接著，我們從體外觀察了PRL1基因siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲的影響。

正常真核細(xì)胞，除成熟血細(xì)胞外，大多需黏附于特定的細(xì)胞外基質(zhì)上才能抑制凋亡而存活，稱為錨著依賴性。腫瘤細(xì)胞可以錨著不依賴性狀態(tài)生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞在軟瓊脂形成集落的多少與惡性程度呈正相關(guān)。軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)PRL1siRNA轉(zhuǎn)染處理的肺癌細(xì)胞軟瓊脂集落數(shù)和穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，且呈濃度依賴性。

Boyden小室模型或Transwell是檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲試驗(yàn)的經(jīng)典模型，已被廣泛應(yīng)用于探討癌細(xì)胞侵襲的相關(guān)研究中。本研究將經(jīng)PRL1siRNA轉(zhuǎn)染處理的肺癌549細(xì)胞置于Boyden小室模型中，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組肺癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，且呈濃度依賴性，提示PRL1下調(diào)可抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力。

本研究提示，PRL1基因在肺癌細(xì)胞侵襲中起著重要的作用，以siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)可明顯抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力，其內(nèi)在機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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