臨床分子生物學檢驗技術-醫(yī)學院課件

1臨床分子生物學檢驗技術第二教學周直播見面課《臨床分子生物學檢驗技術》2利用分子生物學技術研究人體內源和外源性生物大分子即核酸與蛋白質的存在、結構和表達的改變。為疾病的預測、預防、診治和轉歸提供分子水平信息的一門學科。分子生物學檢驗技術核酸雜交技術核酸體外擴增技術核酸實時定量檢測技術核酸序列分析蛋白質組學技術分子生物學檢驗新技術4核酸分子雜交技術概念核酸分子雜交探針經(jīng)典的核酸分子雜交技術固相雜交液相雜交原位雜交反向點雜交Southern印記雜交Northern印記雜交5單鏈的核酸分子在合適的條件下，與具有堿基互補序列的異源核酸形成雙鏈雜交體的過程稱作核酸分子雜交（molecularhybridization）。利用核酸分子雜交檢測靶序列的一類技術稱為核酸分子雜交技術。核酸分子雜交技術廣義的探針是指所有能與特定的靶分子發(fā)生特異性的相互作用，并可以被檢測的分子。

核酸探針（nucleicprobe）:是指帶有可檢測的標記標記，并且能夠與靶序列發(fā)生特異性互補雜交的核酸分子。6核酸探針1.DNA探針基因組DNA探針cDNA探針DNA探針通常為400～500個堿基2.RNA探針3.寡核苷酸探針人工合成，長度一般17~50個核苷酸。檢測點突變和小段堿基的缺失或插入。核酸探針的種類

7（1）放射性標記物放射性同位素是最早使用，也是目前應用最廣泛的探針標記物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P應用最普遍。優(yōu)點：靈敏度高，可檢測到10-18~10-4g的物質；

很高的特異性，假陽性結果較少。缺點：輻射危害（易造成放射性污染）同位素的半衰期限制1.探針標記的選擇8核酸探針的標記（2）非放射性標記物9生物素地高辛熒光化合物生物素是一種小分子水溶性維生素是半抗原，能夠與親和素形成穩(wěn)定的復合物，通過連接在親和素或抗生物素蛋白上的顯色物質(如酶、熒光素等)進行檢測。地高辛是一種類固醇半抗原分子，可利用其抗體進行免疫檢測，原理類似于生物素的檢測。即熒光染料，較常用的有FITC、Cy3、Cy5、羅丹明類。熒光染料標記探針后，再用探針與靶序列結合，利用熒光顯微鏡觀察樣本。熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)熒光，用于檢測靶序列。（1）隨機引物法（2）DNA缺口平移標記（3）全程RNA探針標記（4）化學法全程標記（5）3’末端標記（6）5’末端標記10探針標記方法（1）隨機引物法其原理是利用隨機引物（長6個核苷酸的寡核苷酸片段）能與各種單鏈DNA模板結合，在無53外切酶活性的

DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）的催化下，按53方向合成一新的DNA鏈，將放射性標記的核苷酸摻入到新合成的DNA分子中。1112隨機引物法探針長度受引物和DNA聚合酶ⅠKlenow片段比例的影響?？莶輻U菌蛋白酶(或胰蛋白酶)Klenow片段功能：該片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。作用：Klenow片段常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3ˊ-末端的標記等。

DNA聚合酶I76kD大片段--Klenow片段34kD小片段酶切原理：利用大腸桿菌DNA聚合酶I的多種酶促活性將標記的dNTP摻入新合成DNA鏈中使探針被標記。（2）DNA缺口平移標記14DNA缺口平移標記法探針長度取決于DNaseI和DNA聚合酶I的比例。采用質粒載體轉錄的方法制備RNA探針，最受歡迎的是含有兩種不同啟動子的載體，可以從兩個方向合成RNA，使得可以從同一個質粒中獲得正義和反義的RNA。（3）全程RNA探針標記16啟動子SP6啟動子T7目的基因SP6T7雙向載體T7SP6從T7啟動子轉錄T7RNA聚合酶NTP（一種被標記）35T7SP6從SP6啟動子轉錄SP6RNA聚合酶NTP（一種被標記）35用化學反應將酶連接到探針上，探針片段大小在標記過程不改變，目前用得最多的是生物素和地高辛。（4）化學法全程標記18在探針3`-末端用末端轉移酶摻入一個標記的[α-32P]dNTP。3’末端標記法包括限制酶切和聚合酶合成兩個過程。常用酶：Klenow片段末端標記法和T4DNA聚合酶標記法。（5）3’末端標記19先用堿性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5`-磷酸，在T4多核苷酸激酶的催化下，使ATP分子上的γ磷酸基團轉移到DNA或RNA分子的5’-OH基團上。因此采用γ-32P-ATP為底物，即可將DNA樣品5’端標記。（6）5’末端標記2021核酸分子雜交技術概念核酸分子雜交探針經(jīng)典的核酸分子雜交技術固相雜交液相雜交原位雜交反向點雜交Southern印記雜交Northern印記雜交固相雜交Southern印跡雜交（Southernblot）Northern印記雜交（Northernblot）反向點雜交（reversedotblot，RDB）液相雜交原位雜交經(jīng)典的核酸分子雜交技術22固相雜交是將待測的靶核苷酸鏈預先固定在固體支持物（常用有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、化學活化膜等）上，而標記的探針則游離在溶液中，進行雜交反應后，使雜交分子留在支持物上，故稱固相雜交。常用的固相雜交類型有印跡雜交、組織原位雜交、斑點雜交、菌落雜交等。一、固相雜交2324①將待測核酸分子通過一定的方法結合到一定的固相支持物上，即blotting；②將提前標記好的探針與固定于膜上的核酸在一定的溫度和離子強度下退火，即雜交。EdwinMellorSouthern（一）Southern印跡雜交1975年，蘇格蘭愛丁堡大學E.M.Southern首先設計出來的，故又稱Southernblot。Southern印記雜交（southernblothybridization）技術包括兩個過程：Southern雜交的主要步驟：1）待測核酸樣品的制備2）待測DNA樣品的電泳分離3）凝膠中DNA的變性：堿變性（NaOH溶液）4）Southern轉膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細管虹吸印跡法、電轉印法、真空轉移法5）Southern雜交6）雜交結果的檢測2526（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片Southernblot操作流程提取DNA限制性內切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉移到NC膜與DNA或RNA探針雜交放射自顯影

Southern雜交的主要應用1.單基因遺傳病診斷2.基因點突變檢測3.PCR產物分析271979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。因這種方法與Southernblot雜交技術十分類似，被稱為Northern雜交。基本原理和基本過程與Southernblot基本相同。鑒別RNA探針可用DNA或RNA片段待測樣品為總RNA或mRNA（二）Northern印跡雜交28反向點雜交（reversedotblot,RDB）是1989年Saiki等提出的一種斑點雜交技術。（三）反向點雜交29原理：①將待用探針點到硝酸纖維膜上，每個探針一個點并編號；②將待測的DNA樣本（一般是經(jīng)過標記的）與之雜交③這樣待測樣品與具有同源序列的探針結合，結合了待測DNA的探針點就可以根據(jù)其帶有的標記顯示出雜交信號。應用：應用于病原體檢測，基因分型檢測與基因突變檢測。30反向斑點雜交技術原理

液相雜交是指待測核酸和探針都存在于雜交液中，探針于待測核酸在液體環(huán)境中按照堿基互補配對形成雜交分子的過程。液相雜交是研究最早的雜交類型。二、液相雜交

31原位雜交：將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，利用組織化學或者免疫組化的方法在顯微鏡下進行細胞內定位的技術稱原位雜交（insituhybridization）。能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究；不需從組織或細胞中提取核酸，靈敏度高；能準確反映組織細胞的相互關系及功能狀態(tài)。細胞或染色體的原位雜交，用于基因定位。細菌菌落的原位雜交：篩選陽性克隆。三、原位雜交3233HPVFISH（一）放射性標記探針檢測1.放射自顯影2.液體閃爍計數(shù)法34分子雜交信號檢測（二）非放射性標記探針的雜交檢測最常用的標記物：生物素和地高辛檢測方法

1.酶促顯色檢測

2.熒光檢測

3.化學發(fā)光檢測(ECL,具有定量檢測優(yōu)點）

4.多探針檢測（1）直接檢測：酶作為標記分子參入到核酸中去酶促顯色檢測35酶底物顯色堿性磷酸酶（ALP或AKP）5-溴-4-氯-4-吲哚磷酸（BCIP）紫色化合物辣根過氧化物酶（HRP）二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）DAB---紅棕色沉淀TMB---藍色（2）間接檢測生物素、親和素標記的探針，需要增加一個將酶連接到雜化分子上的步驟。熒光素作為探針標記物，直接與核苷酸結合，利用熒光顯微鏡或者免疫組化的方法進行檢測。常用的熒光素包括異硫氰酸熒光素（FITC）、羥基香豆素、羅達明等。熒光檢測36DNA芯片屬于生物芯片的一種，是基于核酸分子雜交的基本原理，以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作為探針，以顯微打印的方式有序地固化在支持物表面，然后再與經(jīng)過標記的樣品核酸分子雜交，通過對雜交信號進行定性定量分析，獲得待測樣品中的基因序列表達信息。它以其可同時、快速、準確地分析數(shù)以千計的基因組信息而顯示巨大威力。DNA芯片技術37核酸體外擴增及定性檢測技術靶序列擴增PCR擴增技術PCR技術基本原理及過程變性退火延伸PCR反應體系模板引物dNTP耐熱的DNA聚合酶緩沖液（Mg2+）其他PCR技術多重PCR序列特異PCR逆轉錄PCR巢式PCR轉錄依賴擴增系統(tǒng)PCR產物分析探針序列擴增信號擴增PCR（polymerasechainreaction）即聚合酶鏈反應技術，它是以待擴增的兩條DNA鏈為模板，在一對人工合成的寡核苷酸引物的介導下，利用耐熱DNA聚合酶的酶促作用，通過變性-退火-延伸的循環(huán)操作，快速特異地擴增出特定的DNA片斷。PCR原理及基本過程3940PCR原理及基本過程變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C三步循環(huán)PCR原理及基本過程5Primer15Primer2Cycle2Cycle15555

5

5TemplateDNA5555555542Cycle355

5555555

5

55555

525～30次循環(huán)后理論上，可使基因擴增109倍以上，實際上，一般可達106~107倍（why？？？）43PCR反應體系：20ul；25ul；50ul

濃度50ul體系(ul）10×PCRBuffer5Mg2+1.5mmol/L4dNTPs200umol/L4引物110pmol2引物210pmol2模板0.1～2ug1Taq酶2.5u0.5ddH2O31.5PCR反應體系1.模板DNA：來源于基因組DNA或質粒DNA，RNA需要經(jīng)過逆轉錄轉變成cDNA。2.引物：為人工合成的兩條寡核苷酸，決定了PCR產物的特異性。位置：待擴增目的片段的兩端，決定擴增產物的長度長度：一般20~30個核苷酸二級結構：引物內部和引物之間避免存在互補序列堿基分布：隨機分布，組成平衡Tm值：兩條引物Tm值相近，退火溫度是根據(jù)引物的Tm值決定的末端修飾：3′端需嚴格配對，5′端可引入酶切位點、突變位點及生物素、地高辛等標記。PCR反應體系443.脫氧核苷三磷酸（dNTPs）為dATP、dCTP、dGTP和dTTP四種脫氧核苷三磷酸的混合物，四種核苷酸的濃度要一致，過高可使非特異性擴增增加。4.DNA聚合酶最常用的DNA聚合酶為耐熱的TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase），最適溫度為75-80℃，每個酶分子的延伸速度達150nt/s。但是TaqDNA聚合酶缺乏3′→5′核酸外切酶活性，堿基替換率為1/8000，移碼突變率為1/30000。PCR反應體系455.緩沖液一定的鹽離子濃度為PCR提供最適反應條件，其中Mg2+濃度在PCR反應中是一個至關重要的因素。Mg2+是TaqDNA聚合酶不可或缺的輔助因子，濃度過低會使酶的活性低，濃度過高又會增加非特異性擴增。PCR反應體系46PCR擴增參數(shù)47包括溫度、時間和循環(huán)次數(shù)的設置預變性：94℃左右5min變性：94℃左右45S退火：55℃左右45S延伸：72℃1min再延伸：72℃10min28~30cyclesPCR衍生技術48（一）多重PCR（二）序列特異PCR（三）逆轉錄PCR（四）巢式PCR（五）轉錄依賴擴增系統(tǒng)（六）隨機引物PCR（七）全基因組擴增（八）微乳液擴增（九）錨定擴增（十）長片段PCR是在同一反應體系中加入多對引物，同時擴增一份DNA樣品中同一靶DNA或不同靶DNA的多個不同序列片段要求：1.各對引物退火溫度相近2.引物之間不能互補配對3.擴增產物大小不一樣常用來監(jiān)測同一基因中多個外顯子的缺失。（一）多重PCR（multiplexPCR）49指引物設計時使引物3’端堿基與突變序列互補，只有當引物3’端與模板精確互補時才能實現(xiàn)PCR擴增，因此可用于鑒定靶DNA單個堿基的改變。該技術主要用于HLA基因型的檢測。由于假陽性率較高，臨床應用較少（二）序列特異PCR（sequence-specificPCR）50以細胞內總RNA或mRNA為材料進行核酸擴增的技術，必須首先在逆轉錄酶的作用下，將RNA進行逆轉錄反應生成cDNA，然后再以cDNA作為模板進行PCR擴增逆轉錄酶（reversetranscriptase）：從RNA病毒分離出的依賴RNA的DNA聚合酶，具有依賴RNA的DNA聚合酶活性（三）逆轉錄PCR

（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）51兩對引物；先用第一對引物擴增出相對較大的片段；然后再用第二對引物進行第二次擴增，得到實際需要的片段。第二對引物（第二次擴增所用引物）位于第一對引物的內側；常用于靶基因的質和/或量較低或常規(guī)PCR無法得到理想擴增產物時。（四）巢式PCR（nestedPCR）52PCR產物分析53PCR產物分析主要包括定性、定量和序列分析。定性--電泳分析瓊脂糖凝膠電泳--常用于臨床檢測聚丙烯酰胺凝膠電泳--分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測分析一、PCR-限制性片段長度多態(tài)性二、PCR-等位基因特異性寡核苷酸三、PCR-單鏈構象多態(tài)性四、變性梯度凝膠電泳五、熔點曲線分析幾種檢測點突變的實驗技術54采用特定的限制性內切酶對PCR產物進行處理，對酶切后的片段長度進行多態(tài)性分析，用以判斷在酶切位點是否存在點突變的一種方法用于突變恰好位于某一限制性內切酶的識別序列中；限制性內切酶水解PCR產物，產生與正常序列長度不同的片段；電泳分離后，長度不同的片段所處的相對位置不同。一、PCR-限制性片段長度多態(tài)性

PCR-sestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）5556PCR-RFLP是目前最簡單的一種檢測點突變的技術，應用十分廣泛。例：鐮狀紅細胞貧血病的檢測PCR-ASO分析是PCR技術結合ASO探針斑點雜交技術的一種可以檢測一些遺傳病已知的基因突變的診斷方法。二、PCR-等位基因特異性寡核苷酸

（PCR-allelespecificoligonucleotide,PCR-ASO）57PCR-ASO原理：根據(jù)已知基因突變位點的堿基序列，設計和制備野生型或突變型基因序列互補的兩種探針，分別與被檢測者樣品中的DNA分子進行雜交，根據(jù)樣品與兩種探針雜交信號的強弱，確定是否存在基因突變，而且判斷被檢者是突變基因的純合子或雜合體。58ASO探針法ACTGASO探針正常病人59探針雜交NC膜探針正常人突變純合子突變雜合子以等位基因特異的寡糖苷酸探針雜交法診斷某常染色體隱性遺傳病時，若能與突變探針及正常探針接合，則該樣本為A.正常人

B.雜合體患者

C.純合體患

D.攜帶者

E.不能確定單選題60PCR-SSCP是一種以PCR為基礎?；贒NA構象差別而進行快速、靈敏、有效檢測基因點突變的方法。三、PCR-單鏈構象多態(tài)性

（PCR-singlestrandconformationpolymorphism,PCR-SSCP）6162PCR-SSCP基本原理：①PCR擴增的DNA片段在變性劑或低離子濃度下，經(jīng)高溫處理使之解鏈并保持在單鏈狀態(tài)下，DNA單鏈可折疊成一定空間構象。②在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，相同長