基因組學(xué)技術(shù)概要

第一講緒論Genomics：以生物信息學(xué)分析為手段研究基因組的組成、結(jié)構(gòu)、參加進(jìn)行了人體基因作圖，測(cè)定人體23對(duì)染色體由3×109核苷酸組成的全部HGP的目標(biāo):(1)人類DNA測(cè)序(2)發(fā)展測(cè)序技術(shù)(3)鑒定人類基因組變異(4)發(fā)展有效的基因組學(xué)技術(shù)(5)比較基因組學(xué)mn11(1)基因組學(xué)依賴于測(cè)序；(2)基因組學(xué)是數(shù)據(jù)引導(dǎo)的學(xué)科，而不是假說(shuō)驅(qū)動(dòng)的；第二章基因組研究主要網(wǎng)站介紹?蛋白質(zhì)序列(已知的和預(yù)測(cè)的)ibusdbSNPetceO快速找到與長(zhǎng)度大于40個(gè)堿基的序列的相似性大于等于95%的序列，是BLAST-LikeAlignmentTool,但不是BLAST，可用于找到序列在基因組中的位22atedwithatrackintextformattocalculateintersections第三章測(cè)序原理與進(jìn)展一組(4種)熒光標(biāo)記引物，其序列相同，但標(biāo)記的熒光染料顏色不同。定義：將熒光染料標(biāo)記在作為終止底物的雙脫氧單核苷酸上熒光標(biāo)記終止底物法的異同點(diǎn)：33SOLiDSOLiD測(cè)序(雜交的方法)[本版本重點(diǎn)介紹雜交過(guò)程]R堿基，反復(fù)進(jìn)行循環(huán)，便可以邊合成邊測(cè)序)IIuminasequencingtechnology測(cè)序：完成擴(kuò)增，這時(shí)每一個(gè)DNA片段都在平板上擴(kuò)增為了一簇；判斷第一個(gè)堿基(每一輪合成都加入四種不同熒光素序44N[附注：細(xì)心的同學(xué)可能會(huì)有這樣的疑問(wèn)：每一種顏色的熒光都對(duì)應(yīng)四種堿基對(duì) (見(jiàn)上圖)，在確定序列時(shí)怎樣確定第一個(gè)堿基呢？老師上課時(shí)也沒(méi)有講清楚，優(yōu)缺點(diǎn)DNA100bp的片段，將DNA分子變性后在其末端連接A剪切掉堿基上的阻斷集團(tuán)，在加入其他種類的dNTP，同樣的步驟進(jìn)行合成測(cè)序……第四講遺傳圖譜與物理圖譜真核生物在減數(shù)分裂過(guò)程中染色體進(jìn)行重組和交換，染色體上任意兩點(diǎn)之間發(fā)生重組和交換的概率隨著兩點(diǎn)之間相對(duì)距離的遠(yuǎn)近而發(fā)生變化。構(gòu)建遺傳圖譜的意義：55通過(guò)連鎖分析，可以找到某一致病基因或表型的基因與某一標(biāo)記鄰近(緊密連鎖)的證據(jù)，從而可把這一基因定位與染色體的特定區(qū)域，再對(duì)基因進(jìn)行不同的DNA結(jié)構(gòu)按其在染色體上的原始順序和實(shí)際距(1)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequence-taggedsite,STS)圖譜(2)DNA重疊群(DNAcontig)圖譜：3遺傳作圖的標(biāo)記(1)可識(shí)別性：親本間存在多態(tài)性(即差異)(2)可遺傳性：親本間存在的多態(tài)性在后代中可以重演(1)基因標(biāo)記(性狀標(biāo)記)a.形態(tài)學(xué)性狀標(biāo)記，個(gè)體上可以看見(jiàn)的遺傳標(biāo)記基因(如花色\株高\(yùn)體b.生化性狀基因(如血型系列\(zhòng)血清蛋白\免疫蛋白\同工酶)(2)DNA標(biāo)記(DNAmarkers)：以DNA片段為標(biāo)記，通過(guò)DNA片段的電泳66DNA)物77repeat,VNTR)重復(fù)單位長(zhǎng)度為幾十個(gè)核苷酸在不同生物體中存在不同類型，如人類(AC)n(AAN)n植物(AT)n水稻(GA)n(GT)n--檢測(cè)STR：不同樣本重復(fù)區(qū)域有差異(重復(fù)次數(shù)不同)但PCR引物結(jié)合區(qū)域--STR應(yīng)用：微衛(wèi)星具有很大變異性(基因組復(fù)制的“滑移”現(xiàn)象)因此用來(lái)建立醫(yī)鑒定、親緣鑒定等88(1)理論上等位型最多為4，實(shí)際多為2(3)數(shù)量極大(4)SNP與人類易感性疾病有關(guān)，涉及藥物基因組學(xué)(5)編碼區(qū)SNP主要分布于密碼子的第3個(gè)堿基(1)DNA芯片技術(shù)(詳見(jiàn)下圖)(2)液相雜交技術(shù)(詳見(jiàn)下圖)7遺傳作圖--一些概念介紹：孟德?tīng)栠z傳定律(分離、自由組合)。連鎖與部分連鎖。重組99--遺傳作圖的理論基礎(chǔ)(也學(xué)過(guò)瞄一眼就行)&圖譜構(gòu)建：(2)重組熱點(diǎn)的存在(3)近端粒區(qū)&遠(yuǎn)著絲粒區(qū)重組率高(4)性別之間有重組率差異(5)雙交換的存在1、有性雜交(老鼠\果蠅\水稻)2、系譜分析(人\多年生樹(shù)木)3、DNA轉(zhuǎn)移(不能減數(shù)分裂的生物細(xì)菌\酵母)(1)親本分析：a親本間多態(tài)性程度與親緣距離：正相關(guān)，因此要擴(kuò)大親本親緣關(guān)系，以獲b度：有關(guān)-識(shí)別位點(diǎn)堿基數(shù)越多，多態(tài)性片段越長(zhǎng)，多態(tài)性越高同限制酶產(chǎn)生的片段不同，多態(tài)性有差異-篩選具多態(tài)性的分子標(biāo)記-篩選高多態(tài)性的限制酶-控制多態(tài)性標(biāo)記在圖譜中數(shù)量合適、均勻分布(2)作圖群體分析(以雙親為對(duì)照，觀察分子標(biāo)記的帶型重組情況)：b.圖譜長(zhǎng)度(各連鎖群長(zhǎng)度、基因組總長(zhǎng))c.標(biāo)記密度(分子標(biāo)記密度足夠大時(shí)稱高密度圖譜)--遺傳圖譜局限性：分辨率有限(交換數(shù)目&后代有限)、覆蓋面低、排列會(huì)有差錯(cuò)環(huán)節(jié)：染色體(大分子DNA提取)->DNA(大片段DNA克隆)->作圖文庫(kù)(物理作圖)->物理圖譜a.低等生物基因組物理作圖A法息(1)在染色體上位置獨(dú)一無(wú)二(2)序列已知，方便PCR檢測(cè) (1)表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetagEST)來(lái)源于cDNA克隆EST來(lái)(2)SSLP可以建立遺傳圖譜與物理圖譜的聯(lián)系(3)隨機(jī)基因組測(cè)序(注：ppt上原話是“隨機(jī)基因組順序”)A.放射雜交量載體中所產(chǎn)生的的物理作圖中目?jī)?yōu)點(diǎn):單拷貝復(fù)制，不會(huì)基因重組發(fā)生嵌合；的最好方法——克隆指紋排序15為何繪制遺傳圖譜&物理圖譜(1)由上至下：全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序(2)由下至上：基于克隆物理圖的測(cè)序-克隆重疊群指導(dǎo)的測(cè)序(1)由上至下：全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序shotgun稱“霰彈法”，“鳥(niǎo)槍法”(2)由下至上：基于克隆物理圖的測(cè)序-克隆重疊群指導(dǎo)的測(cè)序法：NAerprintingdatabase每五個(gè)泳道就是一個(gè)已知分子量的分子量每五個(gè)泳道就是一個(gè)已知分子量的分子量的makerHindIII切為小片段凝膠電泳，填補(bǔ)上空位ceFISH(fluorescenceinsituhybridization)熒光標(biāo)記的原位雜交技術(shù)——證實(shí)小片段在染色體上的位置。wer(4)Autofinish：填補(bǔ)空缺，提高序列質(zhì)量等。可為填補(bǔ)空缺自動(dòng)挑選模板和Hamilton路徑類算法自成一個(gè)結(jié)點(diǎn)Lander—Waterman模型——計(jì)算覆蓋度(2)DeBruijnGraph(DBG)——EULERPath類算法a轉(zhuǎn)換成圖論問(wèn)題deBruijn圖邊：兩個(gè)K-mers重疊(K-1)個(gè)單元hingoingarcmerge(1)首先移除tips(節(jié)點(diǎn)末端不連接的部分)，有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：(2)再移除bubbles(起始和終止節(jié)點(diǎn)相同的路徑):TourBus算法(3)最后移除錯(cuò)誤的連接困難：(1).基因組組中的重復(fù)序列似，比測(cè)序的讀長(zhǎng)長(zhǎng)很多(2)基因組覆蓋的不均一性(3)處理數(shù)據(jù)量測(cè)序錯(cuò)誤與基因組序列的多態(tài)性第六講：基因組注釋組成了人類基因組的45%，涉及到RNA調(diào)節(jié)物(反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子)或者DNA調(diào)節(jié)物(DNA轉(zhuǎn)座子)。長(zhǎng)末端重復(fù)的轉(zhuǎn)座子(RNA介導(dǎo))長(zhǎng)的散置的片段(LINES)編碼逆轉(zhuǎn)錄酶短的散置片段(SINEs)(RNA介導(dǎo))包括Alu重復(fù)。DNA轉(zhuǎn)座子(組成了人類基因組的3%)4就像失活的拷貝(在這些拷貝中，轉(zhuǎn)座酶不在發(fā)揮作用)fer變，不能編碼有功能的蛋白。(4)部分復(fù)制s連續(xù)存在的多拷貝重復(fù)序列：這包括端粒的重復(fù)和著絲粒的重復(fù)。重復(fù)(“垃圾DNA”)(3)序列多樣性體現(xiàn)在核苷酸水平而不是蛋白質(zhì)水平，所以很難檢測(cè)同源性。(1)利用非PolyA依賴的克隆方法分離(2)微陣列tRNARNA證據(jù)(ESTs)1確定已知基因共有的特征2建立一個(gè)計(jì)算框架/模型，用來(lái)精確的描述這些現(xiàn)象?？捎脕?lái)進(jìn)行基因預(yù)測(cè)的統(tǒng)計(jì)學(xué)特征：的模型及方法：構(gòu)的限制性基因功能，包括結(jié)構(gòu)域分析你感興趣的特異性功能地圖11基因本體論(GO)：第七章轉(zhuǎn)錄組研究Abundant3用標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交2逆轉(zhuǎn)錄擇(1)5’端 (3)兩端測(cè)序(1)去除低質(zhì)量的序列f剪切。發(fā)現(xiàn)新基因是基因組研究的熱點(diǎn),使用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)新基因是后基因組時(shí)代必不可少的方法。利用對(duì)某一特異組織或某一生長(zhǎng)發(fā)育階段的cDNA文庫(kù),進(jìn)行隨機(jī)部分測(cè)序所ESTs序列在以上數(shù)據(jù)庫(kù)中存在同源序列,可對(duì)該ESTs所代表基因的分開(kāi)性的時(shí)T癌癥基因組解析計(jì)劃P所 (2)將短片段標(biāo)簽相互連接形成長(zhǎng)的DNA分子，對(duì)該克隆進(jìn)行測(cè)序得到大量特定的序列標(biāo)簽的出現(xiàn)次數(shù)就反應(yīng)了對(duì)應(yīng)的基因的表達(dá)豐度。同時(shí)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)數(shù)千個(gè)基因的表達(dá)情況樣品的檢測(cè)A.按技術(shù)手段、探針類型分類sAffymetrixB.按實(shí)驗(yàn)要求分類Stanford開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)，通常為雙通道，常用于差異表達(dá)基因的篩選。A.選擇硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龍膜等支持物B.采用光導(dǎo)化學(xué)合成和照相平板印刷技術(shù)在硅片等表面合成寡核苷酸探針;或相應(yīng)位置上7微陣列實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)：NA程度等)4.探針的標(biāo)記5.RNA的抽提6.加樣7.其他因芯片的數(shù)據(jù)分析(1)差異表達(dá)基因的分析(2)基因共表達(dá)分析(3)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的聚類(4)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分類(1)差異表達(dá)基因的分析調(diào)的基因?如果處理本身并不顯著，則結(jié)果無(wú)意義(2)基因共表達(dá)分析：相似的表達(dá)譜，可能存在正關(guān)聯(lián)：相反的表達(dá)譜，可能存在負(fù)調(diào)控(3)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的聚類將表達(dá)譜相似的基因聚類在一起(4)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分類根據(jù)基因表達(dá)的數(shù)據(jù)將樣本分成兩類或多類–癌癥的亞型、不同階段(良性的vs.惡性的)進(jìn)TRssDNA。單鏈DNA病毒?；蚪M小(2-7kb)，且一般為環(huán)狀；二十面體衣dsRNA。雙鏈RNA病毒。二十面體衣殼；衣殼完整地留在細(xì)胞內(nèi)(保護(hù)基A受損；(3)蛋白質(zhì)合成受抑制是普遍現(xiàn)象。是與宿主有相同的命運(yùn)，宿主死亡，則病毒也無(wú)法生存)；侵染多種宿主(優(yōu)勢(shì)優(yōu)化)。和釋放。16、HIV病毒。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，HIV病毒從猿類中起源(生物信息學(xué)工具——LANL)。物具有較高的GC含量)和突變假說(shuō)。LGT的要求&步驟：臨近供體DNA；DNA在環(huán)境中有穩(wěn)定性；載體傳遞；吸收9、MUMmer：比較兩個(gè)高度相關(guān)的序列，遍歷所有至少為某一長(zhǎng)度(比如20第13講利用新一代測(cè)序儀進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究1.基因:表達(dá)，可變剪切3.一些重復(fù)序列copyDNAshearDNA>linkers連接起來(lái)fSOLiD乳膠PCRg)SOLiD測(cè)序Primaryanalysis個(gè)distributereadsC：落在基因外顯子的mappablereads數(shù)量1.分配單一mappringreadsN：mappablereads總數(shù)(庫(kù)間標(biāo)準(zhǔn)化)2.基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化L：基因外顯子長(zhǎng)度(庫(kù)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化)比對(duì)，從概率上分拼接，形成兩個(gè)子庫(kù)(已知junctionA分析：因表達(dá)譜分析：基因表達(dá)譜聚類分析?非編碼區(qū)鑒定與注釋2.整合所有的已知轉(zhuǎn)錄區(qū)，并根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)排序?yàn)檫@些區(qū)域命名效的檢測(cè)?重復(fù)序列表達(dá)分析?內(nèi)含子表達(dá)分析(如候選polyA轉(zhuǎn)錄本，候選-表達(dá)情況尚不明確)芯片-相對(duì)表達(dá)(去背景過(guò)程中可能去掉了與調(diào)控相關(guān))RNA-seq:絕對(duì)表達(dá)?基因產(chǎn)物直系同源簇的分析(COG)EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)的代謝途徑分析-KEGG?優(yōu)勢(shì)：?未知基因組序列的物種的高通量轉(zhuǎn)錄組研究?(相對(duì)于芯片技術(shù))-對(duì)于基因表達(dá)譜有非常寬的檢測(cè)范圍。在有內(nèi)顯示出了較高的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性。?不需要克隆，樣本少，可以在單細(xì)胞水平進(jìn)行表達(dá)譜分析?通量高，成本低A挑戰(zhàn) ?海量短序列數(shù)據(jù)的比對(duì)或拼接情況復(fù)雜，對(duì)重復(fù)序列和多匹配序列剪接和反式剪接的鑒定仍有相當(dāng)?shù)恼`差。 ?測(cè)序深度的確定因物種、器官、組織、時(shí)期而變，很難有統(tǒng)一公式 線蟲(chóng)綱;昆蟲(chóng)：果蠅、按蚊;海膽450MYA:魚(yú)310MYA:恐龍、雞5-50MYA:靈長(zhǎng)目動(dòng)物第一個(gè)基因組被測(cè)出的多細(xì)胞生物?估測(cè)異染色質(zhì)長(zhǎng)度：通過(guò)直接在減數(shù)分X上異染色質(zhì)block有多態(tài)性(1/3~1/2)Y幾乎全部異染色質(zhì)化DNA9%轉(zhuǎn)座子(長(zhǎng)度67%單一序列乎全部序列是重復(fù)性的4蚊(Mosquito)?特征：相似性：?埃及伊蚊基因組?注釋?與其他生物進(jìn)化關(guān)系：5紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)[非脊索后口動(dòng)物中唯一被測(cè)序的，幫助我們了解生物過(guò)程(如氣味感知和免疫過(guò)程)的進(jìn)化]A特征：棘皮動(dòng)物門(mén)，放射對(duì)稱的殼，移動(dòng)緩慢，食藻類，體外受精A基因組?高雜合性因組，補(bǔ)充全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序組裝6玻璃海鞘(Cionaintestinalis)A高等位基因多態(tài)性?轉(zhuǎn)座序列少但是多樣性高?有全基因組復(fù)制(WGD)：輔鰭魚(yú)世系中的WGD有爭(zhēng)議-WGD產(chǎn)緊跟著WGD，染色體重排發(fā)生(分裂，融合，易位)，減少到218雞(Gallusgallus)s 一個(gè)祖先開(kāi)始的染色體易位都很少，而染色體內(nèi)部重排(如倒位)更常見(jiàn)?多基因家族的擴(kuò)展和收縮是哺乳類和鳥(niǎo)類各自獨(dú)立進(jìn)化的主要因素復(fù)序列中反轉(zhuǎn)錄酶具有高特異性(CR1LINE)MB的基因數(shù)和島數(shù)-負(fù)相關(guān)d.平均基因長(zhǎng)度(內(nèi)含子正相關(guān)，外顯子負(fù)9有袋目負(fù)鼠(Opposum)A基因組anislupusfamiliaris?哺乳動(dòng)物基因組差異：狗-最低轉(zhuǎn)座子插入率鼠-最高刪除率人-最低核苷酸?哺乳動(dòng)物中有一套常用的功能序列?50%高保守nc序列cluster在~200基因缺乏區(qū)域。大部分含有在識(shí)別中起重要作用的基因(如轉(zhuǎn)錄因子，軸突指導(dǎo)受體)?鼠特異基因擴(kuò)展：嗅覺(jué)受體基因家族?替換率和插入/缺失率都比人高A黑猩猩基因組:的CpG替換率在雄性與雌性精子中比非CpG區(qū)域更接近?插入刪除比單堿基替換少(逆轉(zhuǎn)錄病毒序列)?人類和黑猩猩的同源蛋白十分相似?原始人類進(jìn)化中的正選擇個(gè)更小的蛋白質(zhì)歧化率?外顯子沉默位點(diǎn)的替換比相鄰的內(nèi)含子位點(diǎn)低>更弱的清潔選擇低重組區(qū)域:G+C低>高分歧；反之……(2)雄性減數(shù)分裂的突變率是雌性的兩倍，大多數(shù)突變發(fā)生在雄性當(dāng)中。(3)超過(guò)1.4百萬(wàn)個(gè)單核苷酸突變多態(tài)性被確定。(3)D組中心粒在染色體的一端。(4)18號(hào)染色體具有最低的基因密度。(5)19號(hào)染色體具有最高的基因密度。(6)Y染色體包括中心粒(1M)，長(zhǎng)臂(40M)，island(400kb)(1)單基因疾病(常顯常隱)，(2)復(fù)雜基因疾病(中樞神經(jīng)疾病)(3)基因組疾病(染色體數(shù)目變化)(4)感染疾病(5)環(huán)境疾病(1)基因組太大。(2)突變機(jī)制較多。(1)比較正常和患者基因(2)基因定位(3)突變效果(4)功能基因組(5)(1)連接分析(家系)(2)GWAS(全基因組關(guān)聯(lián)分析)(3)染色體異常鑒定(4)DNA測(cè)序.分子進(jìn)化:基因或蛋白的進(jìn)化模式和機(jī)制，有時(shí)涵蓋序列基礎(chǔ)上的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)。 .進(jìn)化遺傳學(xué):群體遺傳學(xué)和近緣物種中的物種形成。 .進(jìn)化發(fā)育生物學(xué)(EvoDevo):主要生物(門(mén))的發(fā)育和它們的進(jìn)化結(jié)果的基因進(jìn)化基因組學(xué)的初步定義研究基因組進(jìn)化的機(jī)制以及在基因組水平研究物種及其特征進(jìn)化的遺傳機(jī)制(也稱比較基因組學(xué))的一門(mén)生物學(xué)學(xué)科。進(jìn)化基因組學(xué)的研究方法1.計(jì)算生物學(xué)手段：數(shù)據(jù)分析、挖