動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)成體干細(xì)胞

動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)成體干細(xì)胞第一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五一、概論20世紀(jì)初，Pappenheim等首次提出了成體干細(xì)胞的概念。胚胎干細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行分化，形成具有特定功能的干細(xì)胞，這些專門化的干細(xì)胞統(tǒng)稱多能干細(xì)胞。在胎兒、兒童和成人組織中存在的多能干細(xì)胞統(tǒng)稱“成體干細(xì)胞（Adultstemcell）”。如血液干細(xì)胞可分化成白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板;皮膚干細(xì)胞可形成各種不同類型的皮膚細(xì)胞。第二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

成體干細(xì)胞是指一群分布在成體組織中尚未分化的、具有自我更新、并負(fù)有構(gòu)建和補(bǔ)充某種組織的各種類型細(xì)胞潛能的干細(xì)胞

1997年Wilmut用體外培養(yǎng)的、高度分化的母羊乳腺細(xì)胞核移植入去核卵細(xì)胞，克隆出了新綿羊“Dolly”克隆羊的誕生表明：高度分化的體細(xì)胞仍具有完整的遺傳信息，能重新編排發(fā)育程序，指導(dǎo)胚胎發(fā)育成為一個(gè)完整的新個(gè)體。

第三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五成體干細(xì)胞具有跨越組織或胚層分化的特性稱為成體干細(xì)胞的可塑性或橫向分化

2001年斯坦福大學(xué)的Blau博士等人對(duì)成體干細(xì)胞提出了一個(gè)全新的概念：成體干細(xì)胞是來自許多不同類型細(xì)胞（包括已分化細(xì)胞）的一種“狀態(tài)”，這類細(xì)胞不僅存在特定組織中，還可通過血液到達(dá)軀體的各個(gè)部分，參與各種組織的再生和修復(fù)第四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五成體干細(xì)胞是一種處于尚未分化的、處于干細(xì)胞/祖細(xì)胞/前體細(xì)胞狀態(tài)的成體細(xì)胞，它來源于成年和未成年個(gè)體的組織干細(xì)胞。在正常生理?xiàng)l件下，它傾向于更新、并分化為所在特定組織的若干種細(xì)胞。但在特殊條件誘導(dǎo)下，成體干細(xì)胞能超越特定組織、分化呈其他組織的功能性細(xì)胞，參與其他損傷組織的修復(fù)第五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

最近幾年的研究表明，這些干細(xì)胞的分化能力遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)觀點(diǎn)局限的范圍。例如骨髓成體干細(xì)胞在合適的體內(nèi)外環(huán)境中可長(zhǎng)期生長(zhǎng)，也可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞及多種血管內(nèi)皮細(xì)胞。還可形成一種肝臟前體細(xì)胞－肝卵園細(xì)胞，神經(jīng)、膠質(zhì)細(xì)胞和心肌細(xì)胞。高度純化的造血干細(xì)胞可分化形成肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞；骨骼肌細(xì)胞能分化出造血細(xì)胞；中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞可形成血液細(xì)胞、肌肉和許多其它體細(xì)胞。

成體干細(xì)胞這種跨系統(tǒng)分化特性稱為“可塑性（Plasticity）”。

第六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五二、成體干細(xì)胞的可塑性1、骨髓干細(xì)胞各種血細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞脂肪細(xì)胞成纖維細(xì)胞HSC和MSC的分化全能具有很大的可塑性，可分化為甚至跨越胚層的各種類型細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，骨細(xì)胞，干細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等不同類型的細(xì)胞間質(zhì)干細(xì)胞（MSC）造血干細(xì)胞（HSC）骨髓干細(xì)胞第七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五a.間質(zhì)干細(xì)胞間質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，可分化為內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、肌肉等細(xì)胞的潛能MSC細(xì)胞在異常環(huán)境中，細(xì)胞分化的可塑性增加第八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五b.造血干細(xì)胞

造血干細(xì)胞是體內(nèi)各種血細(xì)胞的唯一來源，它主要存在于骨髓、外周血、臍帶血中。HSC表面存在一些標(biāo)志，可用流式細(xì)胞儀和免疫磁性分選技術(shù)從骨髓細(xì)胞中分離和純化出HSC。HSC移植到不同的環(huán)境可分化為各種不同類型細(xì)胞。

造血干細(xì)胞的移植是治療血液系統(tǒng)疾病、先天性遺傳疾病以及多發(fā)性和轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤疾病的最有效方法。

第九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五神經(jīng)干細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中一類能自我更新、并產(chǎn)生神經(jīng)原和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞

2、神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞等只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化。說明成體干細(xì)胞的分化潛能已經(jīng)受到一定限制。第十頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五神經(jīng)干細(xì)胞移植發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能具有發(fā)育的依賴性，說明神經(jīng)干細(xì)胞的分化潛能已受到一定的限制。但體外培養(yǎng)移植試驗(yàn)表明在一定的為環(huán)境下仍有可塑性。

1999年Bjounson將神經(jīng)干細(xì)胞分化成造血細(xì)胞。開創(chuàng)了成體干細(xì)胞跨越組織和胚層分化研究的先例。神經(jīng)干細(xì)胞的可塑性第十一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

神經(jīng)干細(xì)胞的分布

神經(jīng)管形成以前,在整個(gè)神經(jīng)板檢測(cè)到神經(jīng)干細(xì)胞的選擇性標(biāo)記物神經(jīng)巢蛋白(nestin),是細(xì)胞的骨架蛋白。神經(jīng)干細(xì)胞主要存在于神經(jīng)發(fā)生區(qū)：海馬回和次腦室區(qū),此外，成年嗅球、皮層、室管膜層或者室管膜下層、紋狀體、海馬的齒狀回顆粒細(xì)胞下層等腦組織中分布著神經(jīng)干細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)脊髓、隔區(qū)也分離出神經(jīng)干細(xì)胞脊髓損傷時(shí),來自于神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)元新生受到抑制,而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多,其機(jī)制可能與生成神經(jīng)元的微環(huán)境有關(guān)。第十二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五3、肝干細(xì)胞1958年Wilson等認(rèn)為肝組織中存在著干細(xì)胞，因?yàn)楦谓M織均有營(yíng)養(yǎng)損傷和部分切除時(shí)再生能力。肝卵圓細(xì)胞能在體外大量增值，細(xì)胞移植后可分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，表明肝卵圓細(xì)胞是肝干細(xì)胞。第十三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五肝干細(xì)胞的可塑性肝干細(xì)胞移植到胰腺和十二指腸時(shí)可分化胰腺細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞，表明肝干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中能被誘導(dǎo)分化為內(nèi)胚層的其他組織細(xì)胞。丁酸鈉或二甲亞砜可誘導(dǎo)肝干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-bata）或肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）可誘導(dǎo)肝干細(xì)胞分化為膽上皮細(xì)胞第十四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五4、骨骼肌干細(xì)胞肌肉的生長(zhǎng)、更新和修復(fù)是由肌纖維周圍的衛(wèi)星細(xì)胞介導(dǎo)的——即骨骼肌干細(xì)胞骨骼肌干細(xì)胞不僅可分化為肌肉，而且可分化為血液細(xì)胞成分。具有分化的可塑性第十五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五四、成體干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和特性1、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞半世紀(jì)來造血干細(xì)胞移植治療血液病、自身免疫病和遺傳疾病取得矚目的進(jìn)展。間質(zhì)干細(xì)胞（MSC）能向軟骨、骨、脂肪、造血基質(zhì)和神經(jīng)原樣等細(xì)胞分化。使其首選為組織工程中的種子細(xì)胞。MSC主要來源于骨髓，還可來源于脂肪組織吸取物（PLA）第十六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五2、造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞來源于胚胎期的肝臟和骨髓。全能造血干細(xì)胞可分化為多能淋巴干細(xì)胞和髓性造血干細(xì)胞全能造血干細(xì)胞造血祖細(xì)胞造血前體細(xì)胞判斷造血干細(xì)胞通常用體內(nèi)間接法。脾臟中造血灶稱為集落形成單位（CFU）造血干細(xì)胞的表面抗原CD34為強(qiáng)陽性第十七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五3、神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)和建系，必須滿足兩個(gè)基本條件：1.具有永生化特性2.具有神經(jīng)干細(xì)胞世系遺傳明顯特性，即神經(jīng)干細(xì)胞表型。第十八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

神經(jīng)干細(xì)胞的特點(diǎn)

①神經(jīng)干細(xì)胞可以分化②通過分裂產(chǎn)生相同的神經(jīng)干細(xì)胞來維持自身的存在,同時(shí),也能產(chǎn)生子細(xì)胞并進(jìn)一步分化成各種成熟細(xì)胞③神經(jīng)干細(xì)胞通過兩種方式生長(zhǎng),一種是對(duì)稱分裂,形成兩個(gè)相同的神經(jīng)干細(xì)胞;另一種是非對(duì)稱分裂,由于細(xì)胞質(zhì)中的調(diào)節(jié)分化蛋白不均勻的分配,使得一個(gè)子細(xì)胞不可逆的走向分化的終端而成為功能專一的分化細(xì)胞,另一個(gè)子細(xì)胞則保持親代的特征,仍作為神經(jīng)干細(xì)胞保留下來。分化細(xì)胞的數(shù)目受分化前干細(xì)胞的數(shù)目和分裂次數(shù)控制。第十九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五神經(jīng)干細(xì)胞

由于分離神經(jīng)干細(xì)胞所需的胎兒腦組織較難取材，加之胚胎細(xì)胞研究的爭(zhēng)議尚未平息，神經(jīng)干細(xì)胞的研究仍處于初級(jí)階段。理論上講，任何一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病都可歸結(jié)為神經(jīng)干細(xì)胞功能的紊亂。腦和脊髓由于血腦屏障的存在使之在干細(xì)胞移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)后不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。如：給帕金森氏綜合癥患者的腦內(nèi)移植含有多巴胺生成細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞，可治愈部分患者癥狀。第二十頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五五、成體干細(xì)胞研究中的問題1、異質(zhì)性可塑性可能是由于混雜的幾種和不同類干細(xì)胞分化的結(jié)果一些干細(xì)胞可塑性使用，人們質(zhì)疑所謂“可塑性”可能是混雜幾種或一群不同類型干細(xì)胞分化的結(jié)果干細(xì)胞的異質(zhì)性在遺傳學(xué)種是指由于不同遺傳機(jī)制而產(chǎn)生的相同或類似的表現(xiàn)型異質(zhì)性在某種程度上是干細(xì)胞固有的特性。第二十一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五2、干細(xì)胞所處環(huán)境干細(xì)胞所處的環(huán)境對(duì)于干細(xì)胞的分化命運(yùn)有著重要影響。干細(xì)胞所處的環(huán)境之間精巧而默契的協(xié)調(diào)作用可能是干細(xì)胞“可塑性”的重要原因第二十二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五對(duì)于干細(xì)胞“可塑性”現(xiàn)象的解釋有4種：1）機(jī)體有多種來源和不同分化方向的成體干細(xì)胞群體，能分布定向的向各自來源的細(xì)胞分化2）機(jī)體存在多潛能成體干細(xì)胞，微環(huán)境導(dǎo)致不同分化方向3）特定組織來源的成體干細(xì)胞除分化為特定組織細(xì)胞外，可重新編程，分化為其他細(xì)胞。4）某種成體干細(xì)胞與特定組織來源的干細(xì)胞發(fā)生融合，產(chǎn)生“雜交細(xì)胞”，獲得向后者分化潛能?？伤苄缘恼{(diào)控受外源性因素和內(nèi)源性因子調(diào)控3、可塑性的調(diào)控第二十三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五4、分化細(xì)胞的功能可塑性研究的結(jié)果大多是基于檢測(cè)新生組織的特定蛋白或標(biāo)志物，很少檢測(cè)分化細(xì)胞的功能，但有限不同細(xì)胞具有相同的標(biāo)志物。欲提供干細(xì)胞的終末分還狀態(tài)，應(yīng)基于細(xì)胞表面標(biāo)志鑒別和細(xì)胞功能證明兩方面的依據(jù)。如神經(jīng)細(xì)胞移植后，可塑為血細(xì)胞，即要檢測(cè)起表面標(biāo)志，又要檢測(cè)其造血的功能。第二十四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五5、體外增殖成體干細(xì)胞分離后，目前尚無有效的能較長(zhǎng)期在體外維持未分化狀態(tài)并大量增殖的體外培養(yǎng)方法。常用的手段：1）分離的干細(xì)胞直接移植入動(dòng)物或病人2）體外將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為所需的成熟細(xì)胞，隨后進(jìn)行移植。如皮膚干細(xì)胞移植到燙傷病人，雖可愈合，但不能產(chǎn)生汗腺。第二十五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五六、成體干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)中，可利用成體干細(xì)胞于創(chuàng)傷修復(fù)、疾病的細(xì)胞治療、整形外科學(xué)和組織工程學(xué)等需要組織工程的核心是由種子細(xì)胞和生物活性材料構(gòu)成三維空間復(fù)合體具有足夠數(shù)量并保持特定生物學(xué)活性的重組細(xì)胞是組織工程最基本的要素。第二十六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五通過組織工程構(gòu)建的組織，不僅能對(duì)病損組織進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重建并達(dá)到永久性替代的目的，而且還可以隨著身體生長(zhǎng)的變化而一同變化。第二十七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五1、組織工程化皮膚完全克隆是皮膚真正的干細(xì)胞，具有超常的自我更新能力，可被作為皮膚移植的種子細(xì)胞，且P63蛋白是角質(zhì)細(xì)胞干細(xì)胞的標(biāo)志物第二十八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五2、組織化骨骼骨骼涉及三維立體結(jié)構(gòu)，所需組織包括骨、軟骨、脂肪、血發(fā)生支持基質(zhì)等。必須由適當(dāng)?shù)纳锘钚圆牧蠘?gòu)建成三維支架進(jìn)行培養(yǎng)第二十九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五3、骨髓組織工程骨髓至少含兩類干細(xì)胞（HSC和SSC）能產(chǎn)生血管、骨、軟骨、骨骼肌、心肌、肝以及神經(jīng)細(xì)胞等在組織工程中常優(yōu)先考慮作為種子細(xì)胞來源。優(yōu)點(diǎn)：容易收集，具有明顯的表面標(biāo)志物第三十頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五七、成體干細(xì)胞的去向成體干細(xì)胞經(jīng)常位于特定的微環(huán)境中。微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞能夠產(chǎn)生一系列生長(zhǎng)因子或配體，與干細(xì)胞相互作用，控制干細(xì)胞的去向?；蛘弋a(chǎn)生新的干細(xì)胞?；蛘甙匆欢ǖ某绦蚍只纬尚碌墓δ芗?xì)胞，從而使組織和器官保持生長(zhǎng)和衰退的動(dòng)態(tài)平衡。第三十一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

（1）細(xì)胞內(nèi)蛋白對(duì)干細(xì)胞分裂的調(diào)控:細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，特別是細(xì)胞骨架成分對(duì)細(xì)胞的發(fā)育非常重要。收縮體與紡錘體的結(jié)合決定了干細(xì)胞分裂的部位。（2）轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控1.內(nèi)源性調(diào)控第三十二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五2.外源性調(diào)控（1）分泌因子

間質(zhì)細(xì)胞能夠分泌許多因子，維持干細(xì)胞的增殖，分化和存活。（2）膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間的相互作用

有些信號(hào)是通過細(xì)胞-細(xì)胞的直接接觸起作用的。（3）整合素與細(xì)胞外基質(zhì)

整合素家族是介導(dǎo)干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附的最主要的分子。整合素與其配體的相互作用為干細(xì)胞的非分化增殖提供了適當(dāng)?shù)奈h(huán)境。第三十三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五八、成體干細(xì)胞優(yōu)勢(shì)1、成體干細(xì)胞可從患者自身獲得，而不存在組織相容性的問題，治療時(shí)可避免長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑對(duì)患者的傷害。胚胎干細(xì)胞免疫排斥，因此要對(duì)患者進(jìn)行長(zhǎng)期免疫抑制劑治療或?qū)⒒颊叩脑煅到y(tǒng)和外來細(xì)胞形成嵌合體。治療性克?。簩⒒颊叩捏w細(xì)胞核移植到去核的健康供體卵細(xì)胞中，在體外克隆并隨后發(fā)育分化產(chǎn)生攜帶患者自己MHC的胚胎干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞發(fā)育分化過程中極高的非整倍體發(fā)生率。體細(xì)胞克隆所需的卵細(xì)胞難以獲得。第三十四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

2、胚胎干細(xì)胞能分化成各種細(xì)胞類型，但這種分化是“非定位性”的。當(dāng)前的做法容易導(dǎo)致畸胎瘤。在應(yīng)用胚胎干細(xì)胞治療前，必須先進(jìn)行初步的細(xì)胞誘導(dǎo)分化，以防止畸胎瘤的發(fā)生。也必須確認(rèn)胚胎干細(xì)胞供者沒有諸如（?。I(yíng)養(yǎng)失調(diào)癥之類的遺傳性疾病。相對(duì)而言，成體干細(xì)胞不存在上述問題，例如骨髓移植實(shí)驗(yàn)并不引發(fā)畸胎瘤。第三十五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

3、成體干細(xì)胞也具有類胚胎干細(xì)胞的高度分化能力有科學(xué)家提出了成體干細(xì)胞研究的新假說，即在人體發(fā)育的過程中，成體干細(xì)胞是存留在多種組織中、具有多系分化能力的亞全能干細(xì)胞群體，這些細(xì)胞都具有相同或相似的細(xì)胞表型，在適合的微環(huán)境下可分化成多種組織細(xì)胞。成體干細(xì)胞移植是治療血液系統(tǒng)疾病、先天性遺傳疾病以及多發(fā)性和轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤疾病的最有效方法。

第三十六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五五、干細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用

1.疾病治療研究干細(xì)胞增殖和分化機(jī)制的最終目的是應(yīng)用干細(xì)胞治療疾病。理論上講，干細(xì)胞可以用于各種疾病的治療，但其最適合的疾病主要是組織壞死性疾病如缺血引起的心肌壞死，退行性病變?nèi)缗两鹕C合癥，自體免疫性疾病如胰島素依賴型糖尿病等。第三十七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五2.體外制造人體器官干細(xì)胞和動(dòng)物工程的結(jié)合將有可能解決這一問題。比如通過形成嵌合體，在嚴(yán)格的控制下，使動(dòng)物的某些器官來源于人體干細(xì)胞。這些來自人體干細(xì)胞的器官可應(yīng)用于臨床移植治療。第三十八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

（1）應(yīng)用干細(xì)胞治療疾病有著廣泛的前景。