分子微生物學(xué)

分子微生物學(xué)第一頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五課程教學(xué)主要內(nèi)容（理論22學(xué)時）第1章緒論（2學(xué)時）第2章基因∕基因組的結(jié)構(gòu)特點（2學(xué)時）第3章基因表達調(diào)控（4學(xué)時）第4章分子生物學(xué)研究方法（DNA、RNA、蛋白質(zhì)操作技術(shù)）（8學(xué)時）第5章分子生物學(xué)研究方法（基因功能研究技術(shù)）（2學(xué)時）

分子生物學(xué)讀書報告（4學(xué)時）

第二頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五課程教學(xué)主要內(nèi)容（實驗18學(xué)時）質(zhì)粒的分離和純化；瓊脂糖凝膠電泳；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）；DNA連接與TA克??；感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化；限制性內(nèi)切酶與DNA消化。第三頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五課程教學(xué)主要內(nèi)容（實驗18學(xué)時）（實驗方式：每組自行設(shè)計實驗方案，實驗材料每組自己確定，老師進行輔導(dǎo)和點評，根據(jù)每組實驗的最終結(jié)果進行評分）理論部分（讀書報告PPT占50%），實驗部分占50%?？己朔绞剑旱谒捻摚惨话倭隧?，編輯于2023年，星期五朱玉賢李毅Microbiology

鄭曉峰.現(xiàn)代分子生物學(xué)(第3版)[M].北京：高等教育出版社，2010JamesD.Watson.etal.MolecularBiologyoftheGene,5thEd[M],2004LehningerPrinciplesofBiochemistry5thEd[M]，2005第五頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五專業(yè)基礎(chǔ)課：分子生物學(xué)是從分子水平研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能，從而闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)的科學(xué)。通過本課程的學(xué)習(xí)，使同學(xué)們初步掌握分子生物學(xué)基本原理和研究方法，提高學(xué)生使用所學(xué)知識回答或解決相關(guān)的理論問題和實際問題的能力。第六頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五課程大綱：緒論基因∕基因組的結(jié)構(gòu)特點DNA的復(fù)制DNA的損傷、修復(fù)和突變RNA轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)翻譯原核生物、真核生物基因表達調(diào)控分子生物學(xué)研究方法第七頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第1章緒論第一節(jié)、分子生物學(xué)的發(fā)展和概念第二節(jié)、DNA是遺傳物質(zhì)第三節(jié)、分子生物學(xué)的研究內(nèi)容和發(fā)展簡史第八頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五學(xué)科地位是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快的前沿領(lǐng)域正在與其它學(xué)科廣泛交叉與滲透的重要前沿領(lǐng)域生理學(xué)微生物學(xué)免疫學(xué)病理學(xué)藥理學(xué)分子生物學(xué)臨床醫(yī)學(xué)第九頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五分子生物學(xué)的三大支撐學(xué)科第十頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)、分子生物學(xué)的發(fā)展和概念描述性生物學(xué)數(shù)、理、化相關(guān)學(xué)科滲透、交叉生物學(xué)實驗技術(shù)實驗生物學(xué)近代生物學(xué)個性共性微觀生物學(xué)（分子生物學(xué)為核心）宏觀生物學(xué)（生態(tài)學(xué)為核心）細胞水平分子水平結(jié)構(gòu)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等新興學(xué)科生物多樣性資源保護與利用生態(tài)學(xué)、環(huán)境保護、持續(xù)發(fā)展第十一頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五人類對生命現(xiàn)象的認識20世紀(jì)個體染色體基因DNA逐步深刻的認識基因的概念基因的本質(zhì)基因的功能第十二頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五人類對生命現(xiàn)象的認識21世紀(jì)整體論揭示生命的奧秘“組學(xué)”“系統(tǒng)生物學(xué)”GenomeTranscriptomeProteinome第十三頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五21世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展的重要態(tài)勢對生命現(xiàn)象的認識從單基因水平向全基因組整體水平發(fā)展現(xiàn)代生命科學(xué)研究的理論與技術(shù)從較長期的積累走向應(yīng)用第十四頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五二、分子生物學(xué)的概念分子生物學(xué)概念廣義的分子生物學(xué)蛋白質(zhì)核酸狹義的分子生物學(xué)核酸第十五頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)及核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的研究都屬于分子生物學(xué)的范疇，即從分子水平闡明生命現(xiàn)象和生物學(xué)規(guī)律偏重于核酸（基因）的分子生物學(xué)，主要研究基因或DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達和調(diào)控等過程，以涉及與這些過程相關(guān)的蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)與功能的研究基因的分子生物學(xué)MolecularBiology廣義的分子生物學(xué)：狹義的分子生物學(xué)：第十六頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)、DNA是遺傳物質(zhì)遺傳物質(zhì)的特性:①存儲并表達遺傳信息；②能把遺傳信息傳遞給子代；③物理和化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；④有遺傳變異的能力。DNA具有上述特性，適合作為遺傳物質(zhì)。第十七頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五DNA是遺傳物質(zhì)實驗美國微生物學(xué)家Avery1944年首先用實驗證明基因的化學(xué)本質(zhì)就是DNA轉(zhuǎn)化（Transformation）實驗第十八頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第十九頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五實驗表明：加熱致死的S型肺炎球菌的存在使得R型細菌恢復(fù)了生成莢膜的能力。S型肺炎球菌抽提液中含有一種轉(zhuǎn)化因子。（TransformingFactor）轉(zhuǎn)化因子是DNA。第二十頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)分子生物學(xué)研究內(nèi)容和發(fā)展簡史一、分子生物學(xué)的三大領(lǐng)域：

*

基因的分子生物學(xué)：基因的概念、結(jié)構(gòu)、復(fù)制、表達、重組、交換

*

結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)：生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能生物大分子之間的互作DNA－蛋白質(zhì)激素和受體酶和底物

*

生物技術(shù)理論與應(yīng)用

基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、蛋白質(zhì)工程第二十一頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五生物技術(shù)診斷試劑植物品種食品加工廢物處理民用制品治療藥物畜用制品環(huán)境工程生物塑料再生能源第二十二頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五二、分子生物學(xué)發(fā)展史第二十三頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第二十四頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第二十五頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第二十六頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第二十七頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五遺傳信息傳遞的中心法則（CentralDogma）DNARNA轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)翻譯復(fù)制Crick（英）1958年第二十八頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第二十九頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第三十頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五

1965Jacob＆Monod（法國）FrancisJacob

JacquesMonod

提出并證實了操縱子（Operon）學(xué)說首次提出mRNA分子的存在獲得了1965年的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎第三十一頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五

1975Temin&Baltimore(美)諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎HowardM.TeminDavidBaltimore發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶（以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄生成DNARNA腫瘤病毒）第三十二頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五FrederickSangerWalterGilbertPaulBerg

1980Sanger、Gilbert&Berg諾貝爾化學(xué)獎酶法核苷酸測序的設(shè)計者Sanger測定了牛胰島素的化學(xué)結(jié)構(gòu)而獲1958年的Nobel化學(xué)獎化學(xué)測序法的設(shè)計者DNA重組技術(shù)第三十三頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五

1984Kohler（德）Milstein（美）Jerne（丹麥）

諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎GeorgesJ.F.KohlerCesarMilsteinNielsK.Jerne發(fā)展了單克隆抗體(MonoclonalAntibodiesMcAb)技術(shù)，完善了極微量蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)第三十四頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五

1988McClintock(美)可移動的遺傳因子（jumpinggeneormobileelement）BarbaraMcClintock50年代初發(fā)現(xiàn)88年獲獎第三十五頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五

1989Altman＆Cech（美）諾貝爾化學(xué)獎發(fā)現(xiàn)了核酶（即某些RNA具有酶的功能）SidneyAltman

ThomasR.Cech

第三十六頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五1993年-2001年在分子生物學(xué)領(lǐng)域均有諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎或諾貝爾化學(xué)獎獲得Mullins，1990發(fā)明PCR技術(shù),獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎第三十七頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五技術(shù)上的3大發(fā)明

1.“基因剪刀”—限制性核酸內(nèi)切酶發(fā)明

1970年，SmithWilcox在流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)中分離純化了HindII，取得了突破，打破了基因工程的禁固，迎來了改造生物，為基因工程技術(shù)，為分子生物學(xué)技術(shù)奠定了最為主要的技術(shù)基礎(chǔ)。第三十八頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五基因工程（技術(shù)）誕生的第2個技術(shù)準(zhǔn)備有了切割與縫合（連接酶）基因DNA，還沒一個“車子”，將重組DNA送到主細胞中去。從1946年起，Lederberg就研究細菌性因子，即F因子，50～60年代相繼發(fā)現(xiàn)了R因子（抗藥性因子）、COE（大腸桿菌因子）等質(zhì)粒。直到1973年，Cohen才將質(zhì)粒作為基因工程載體使用，這是基因工程的第2個技術(shù)準(zhǔn)備。2.載體（“車子”）第三十九頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五3.逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)打破了遺傳學(xué)的中心法則，使真核基因的制備成為可能。第四十頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五人類基因組研究人類的全部遺傳信息包含在23對染色體上，每個DNA分子由3.3×109核苷酸組成,編碼5～10萬個基因。人類基因組研究的對象是人類基因組，因此也稱為“基因組學(xué)”。第四十一頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五目前及今后相當(dāng)長時期內(nèi)，將在基因研究、基因表達調(diào)控研究、結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)研究、信號傳導(dǎo)等四大前沿領(lǐng)域開展深入持久的工作，并由此開拓新的前沿領(lǐng)域和新的生長點。

第四十二頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五分子生物學(xué)的發(fā)展前景光輝燦爛，道路艱難曲折！第四十三頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第2章基因∕基因組的結(jié)構(gòu)特點第四十四頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五1、基因的概念和結(jié)構(gòu)基因是核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位，是RNA和蛋白質(zhì)相關(guān)遺傳信息的基本存在形式，是指貯存RNA序列信息和有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈序列信息、以及表達這些信息所必需的全部核苷酸序列。大部分生物中構(gòu)成基因的核酸物質(zhì)是DNA，少數(shù)生物（如RNA病毒）中是RNA。第四十五頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五基因的化學(xué)結(jié)構(gòu)DNA一級結(jié)構(gòu)（primarystructure)

指DNA分子中核苷酸的排列順序二級結(jié)構(gòu)（secondarystructure)

指兩條DNA單鏈形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)（tertiarystructure）指雙鏈DNA進一步扭曲形成的超螺旋結(jié)構(gòu)第四十六頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五DNA和RNA和化學(xué)組成元素組成：（C、H、O、N、P）分子組成：堿基（base）：嘌呤堿、嘧啶堿戊糖（ribose）：核糖、脫氧核糖磷酸（phosphate）第四十七頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五2、基因組結(jié)構(gòu)基因組通常是指全部一套基因，包括編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控序列以及目前功能還尚不清楚的DNA序列。原核生物（如細菌），多為單倍體（在一般情況下只有一條染色體）真核微生物，多條染色體，有時為雙倍體。第四十八頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五基因組結(jié)構(gòu)的特點1、原核生物（細菌、古生菌）的基因組1）染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子（單倍體）；2）基因組上遺傳信息具有連續(xù)性；基因數(shù)基本接近由它的基因組大小所估計的基因數(shù)一般不含內(nèi)含子，遺傳信息是連續(xù)的而不是中斷的。微生物基因組DNA絕大部分用來編碼蛋白質(zhì)、RNA；用作為復(fù)制起點、啟動子、終止子和一些由調(diào)節(jié)蛋白識別和結(jié)合的位點等信號序列。第四十九頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五基因組結(jié)構(gòu)的特點1、原核生物（細菌、古生菌）的基因組1）染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子（單倍體）；2）基因組上遺傳信息具有連續(xù)性；3）功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成操縱子結(jié)構(gòu)；4）結(jié)構(gòu)基因的單拷貝及rRNA基因的多拷貝；5）基因組的重復(fù)序列少而短；操縱子（operon）：功能相關(guān)的幾個基因前后相連，再加上一個共同的調(diào)節(jié)基因和一組共同的控制位點（啟動子、操作子等）在基因轉(zhuǎn)錄時協(xié)同動作。第五十頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第五十一頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五基因組結(jié)構(gòu)的特點2、真核微生物（啤酒酵母）的基因組1）典型的真核染色體結(jié)構(gòu)；2）沒有明顯的操縱子結(jié)構(gòu)；3）有間隔區(qū)（即非編碼區(qū)）和內(nèi)含子序列；4）重復(fù)序列多；第五十二頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列定義：與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的、結(jié)構(gòu)基因以外的序列。原核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列啟動子（promoter）是RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的DNA序列。位于結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始點的上游，啟動子本身并不被轉(zhuǎn)錄。第五十三頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五大腸桿菌基因及調(diào)控序列第五十四頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五終止子（terminater）終止子是結(jié)構(gòu)基因3ˊ端下游的一段DNA序列，其中有GC富集區(qū)組成的反向重復(fù)序列，轉(zhuǎn)錄后在RNA分子中形成特殊的結(jié)構(gòu)以終止RNA鏈的延伸。第五十五頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五3、操縱元件（operator）操縱元件是被阻遏蛋白識別與結(jié)合的一小段DNA序列（阻遏蛋白與操縱元件結(jié)合后抑制下游結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄）第五十六頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五4、正調(diào)控蛋白結(jié)合位點在弱啟動子附近有一些特殊的DNA序列，轉(zhuǎn)錄激活蛋白可以識別并結(jié)合這種DNA序列，該蛋白可與RNA聚合酶作用，促進轉(zhuǎn)錄的啟動。這種DNA序列就是正調(diào)控蛋白結(jié)合位點。第五十七頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五啟動子的上游有CAP蛋白識別位點，CAP被cAMP激活后，能夠結(jié)合于該識別位點，激活下游結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。第五十八頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的DNA序列稱為順式作用元件。包括啟動子、上游啟動子元件、增強子、加尾信號和一些反應(yīng)元件等。第五十九頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第六十頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列啟動子（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）上游啟動子元件（CAAT盒、CACA盒、GC盒）增強子反應(yīng)元件Poly(A)尾第六十一頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第3章基因的表達與調(diào)控第六十二頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五基因表達調(diào)控的基本概念克隆基因的表達原核基因調(diào)控機制第六十三頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)基因表達調(diào)控的基本概念一、基因表達的概念geneexpression

：基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程。對這個過程的調(diào)節(jié)就稱為generegulation

。rRNA、tRNA編碼基因轉(zhuǎn)錄合成RNA的過程也屬于基因表達第六十四頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五二、基因表達的方式組成性表達(constitutiveexpression)適應(yīng)性表達(adaptiveexpression）第六十五頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五

1、組成性表達：

指不大受環(huán)境變動而變化的一類基因表達。某些基因在一個個體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達，通常被稱為管家基因(housekeepinggene)。第六十六頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五

2、適應(yīng)性表達指環(huán)境的變化容易使其表達水平變動的一類基因表達。應(yīng)環(huán)境條件變化基因表達水平增高的現(xiàn)象稱為誘導(dǎo)(induction)，這類基因被稱為可誘導(dǎo)的基因(induciblegene)；相反，隨環(huán)境條件變化而基因表達水平降低的現(xiàn)象稱為阻遏(repression)，相應(yīng)的基因被稱為可阻遏的基因(repressiblegene)。第六十七頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五三、基因表達的規(guī)律

——時間性和空間性1、時間特異性（temporalspecificity）按功能需要，某一特定基因的表達嚴(yán)格按特定的時間順序發(fā)生，稱之為基因表達的時間特異性。第六十八頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第六十九頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五2、空間特異性(spatialspecificity)在個體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在個體按不同組織空間順序出現(xiàn)，稱之為基因表達的空間特異性。基因表達伴隨時間順序所表現(xiàn)出的這種分布差異，實際上是由細胞在器官的分布決定的，所以空間特異性又稱細胞或組織特異性(cellortissuespecificity)。第七十頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五四、基因表達調(diào)控的生物學(xué)意義適應(yīng)環(huán)境、維持生長和增殖（原核、真核）維持個體發(fā)育與分化（真核）第七十一頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)克隆基因的表達第七十二頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五一、基因的表達過程基因表達的多級調(diào)控（一）DNA水平基因丟失、甲基化修飾、基因重排（二）RNA水平轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控RNA的轉(zhuǎn)錄后加工mRNA從核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)運mRNA穩(wěn)定性第七十三頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五一、基因的表達過程基因表達的多級調(diào)控（三）蛋白質(zhì)水平翻譯過程翻譯后加工蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性第七十四頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五一、基因的表達過程基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素1、特異的DNA序列如啟動子序列，操縱子序列，Pribnow盒，GC序列等2、調(diào)節(jié)蛋白如阻遏蛋白，激活蛋白，CAP，轉(zhuǎn)錄因子等3、DNA-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用4、RNA聚合酶第七十五頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第七十六頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第七十七頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五外源基因原核表達真核表達第七十八頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五二、外源基因在原核中表達用原核生物做宿主第七十九頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（一）大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，共有4405個開放閱讀框基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物第八十頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（一）大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素第八十一頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（二）原核生物基因表達的特征1、只有一種RNA多聚酶識別原核細胞的啟動子（真核細胞有三種），催化所有RNA的合成，不識別真核基因的啟動子。2、以操縱子為單位整個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與其調(diào)控區(qū)結(jié)合形成一個表達的協(xié)調(diào)單位。調(diào)控區(qū)主要分為三個部分：操作基因（operator）、啟動子（promotor）及其他有調(diào)控功能的部位。第八十二頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第八十三頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五3、轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進行第八十四頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五4、不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)。5、調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上。一是起始控制（啟動子控制），二是終止控制（衰減子控制）。6、mRNA的核糖體結(jié)合位點。含有一個起始密碼子和一段同核糖體16SRNA3ˊ末端堿基互補的序列，SD序列。第八十五頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（三）原核表達系統(tǒng)的注意事項1、通過表達載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白。（如T7啟動子的強轉(zhuǎn)錄表達）2、外源基因不能帶有內(nèi)含子，必須用cDNA，不能直接用真核基因組DNA。3、必須利用原核細胞的強啟動子和SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達。4、外源基因與表達載體連接后，必須形成正確的開發(fā)閱讀框。5、防止外源基因產(chǎn)物對宿主細胞的毒害。第八十六頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（四）影響外源基因表達效率的因素1、啟動子的結(jié)構(gòu)對表達效率的影響（1）一致順序①-35box5’-TTGACA-3’②-10box5’-TATAAT-3’第八十七頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（四）影響外源基因表達效率的因素1、啟動子的結(jié)構(gòu)對表達效率的影響（2）-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離這兩個保守區(qū)間的距離越是接近于17bp，啟動子的活性就越強。第八十八頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（四）影響外源基因表達效率的因素2、翻譯起始序列對表達效率的影響（1）SD序列（5‘-GGAGG-3’）（2）起始密碼子第八十九頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（四）影響外源基因表達效率的因素3、啟動子與外源基因之間的距離SD與AUG的距離也影響翻譯（7個較好）4、載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對表達效率的影響5、外源蛋白在細菌中的穩(wěn)定性影響表達效率第九十頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（五）提供表達水平常用的方法1、選擇強啟動子序列，如tac等2、調(diào)整SD序列與AUG的距離3、選擇偏愛性密碼子4、增加mRNA拷貝數(shù)5、減輕宿主細胞的代謝負荷（1）誘導(dǎo)表達將宿主生長代謝與外源基因表達分開（溫度誘導(dǎo)、藥物誘導(dǎo)）第九十一頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第九十二頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（五）提供表達水平常用的方法5、減輕宿主細胞的代謝負荷（2）表達載體誘導(dǎo)復(fù)制當(dāng)需要宿主大量生長時，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制。當(dāng)宿主大量生長后，再誘導(dǎo)載體質(zhì)粒的復(fù)制，增加拷貝數(shù)。第九十三頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（五）提供表達水平常用的方法6、提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性防止被宿主的酶降解（1）設(shè)計融合蛋白第九十四頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（五）提供表達水平常用的方法6、提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性防止被宿主的酶降解（2）使用突變菌株，保護外源蛋白不被降解（3）表達分泌蛋白（外排、分泌）第九十五頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)分泌的條件信號肽第九十六頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五三、外源基因在真核細胞中的表達酵母菌、動物培養(yǎng)細胞等第九十七頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（一）真核表達的優(yōu)點具有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)：可識別并刪除基因內(nèi)的內(nèi)含子，剪切加工為成熟mRNA。具備完善的翻譯后加工系統(tǒng)：可進行糖基化、乙?；刃揎棧沟鞍踪|(zhì)形成正確的天然構(gòu)型，有利于其功能、生物活性的研究?？蓪崿F(xiàn)真正的分泌表達：可將基因表達產(chǎn)物分泌到細胞培養(yǎng)液中，簡化了純化工藝，降低了生產(chǎn)成本。第九十八頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（二）真核基因表達調(diào)控特點1、基因表達的調(diào)控是多層次、多方面第九十九頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（二）真核基因表達調(diào)控特點2、一條成熟的mRNA只能翻譯成一條多肽。3、轉(zhuǎn)錄和翻譯在時間和空間是完全分開的。第一百頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（三）基因表達調(diào)控模式1、轉(zhuǎn)錄前水平（基因組水平）基因結(jié)構(gòu)的改變：突變、重排、缺失、擴增特點：穩(wěn)定持久、不可逆2、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控順式作用元件正性條件作用：啟動子，增強子負性調(diào)節(jié)作用：沉默子、加尾和轉(zhuǎn)錄信號反式作用元件：啟動轉(zhuǎn)錄因子，終止因子等。第一百零一頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（三）基因表達調(diào)控模式3、RNA轉(zhuǎn)錄后加工hnRNA經(jīng)過加帽，加尾，切除內(nèi)含子，拼接外顯子，形成mRNA4、翻譯水平的調(diào)控主要是反義RNA對mRNA、tRNA、rRNA5、翻譯后的調(diào)控切除信號肽、糖基化、甲基化、乙?；?、磷酸化第一百零二頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（四）真核表達系統(tǒng)的特點選擇標(biāo)記；②啟動子；③轉(zhuǎn)錄、翻譯、終止信號；④給mRNA加poly(A)的信號如果載體是質(zhì)粒，則還需要復(fù)制起始位點。如果載體要整合到宿主細胞染色體上，則需要一段與宿主染色體DNA

有同源性的序列大多數(shù)真核表達載體都是穿梭載體。酵母、昆蟲、哺乳動物細胞第一百零三頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)原核基因調(diào)控機制第一百零四頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)容提要：原核基因表達調(diào)控環(huán)節(jié)操縱子學(xué)說原核基因調(diào)控機制的類型與特點轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的其他形式

第一百零五頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五一、原核基因表達調(diào)控環(huán)節(jié)1、轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控（transcriptionalregulation）2、轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控（post-transcriptionalregulation）mRNA加工成熟水平上的調(diào)控翻譯水平上的調(diào)控第一百零六頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第一百零七頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五二、操縱子學(xué)說第一百零八頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五三、原核基因調(diào)控機制的類型與特點1、根據(jù)操縱子對調(diào)節(jié)蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白）的應(yīng)答，可分為：正轉(zhuǎn)錄調(diào)控負轉(zhuǎn)錄調(diào)控第一百零九頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因阻遏蛋白激活蛋白正轉(zhuǎn)錄調(diào)控負轉(zhuǎn)錄調(diào)控正轉(zhuǎn)錄調(diào)控如果在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因是關(guān)閉的，加入這種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因活性就被開啟，這樣的調(diào)控正轉(zhuǎn)錄調(diào)控。第一百一十頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因阻遏蛋白激活蛋白正轉(zhuǎn)錄調(diào)控負轉(zhuǎn)錄調(diào)控負轉(zhuǎn)錄調(diào)控在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因是表達的，加入這種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因表達活性便被關(guān)閉，這樣的調(diào)控負轉(zhuǎn)錄調(diào)控。第一百一十一頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五2、根據(jù)操縱子對某些能調(diào)節(jié)它們的小分子的應(yīng)答，可分為可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)和可阻遏調(diào)節(jié)兩大類：可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)：指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質(zhì)的誘導(dǎo)下使基因活化。例：大腸桿菌的乳糖操縱子分解代謝蛋白的基因第一百一十二頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五酶合成的誘導(dǎo)操縱子模型調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因阻遏蛋白調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因阻遏蛋白誘導(dǎo)物mRNA酶蛋白誘導(dǎo)物如果某種物質(zhì)能夠促使細菌產(chǎn)生酶來分解它，這種物質(zhì)就是誘導(dǎo)物。第一百一十三頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五可阻遏調(diào)節(jié)：基因平時是開啟的，處在產(chǎn)生蛋白質(zhì)或酶的工作過程中，由于一些特殊代謝物或化合物的積累而將其關(guān)閉，阻遏了基因的表達。例：色氨酸操縱子合成代謝蛋白的基因第一百一十四頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五酶合成的阻遏操縱子模型調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物輻阻遏物如果某種物質(zhì)能夠阻止細菌產(chǎn)生合成這種物質(zhì)的酶，這種物質(zhì)就是輔阻遏物。第一百一十五頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五3、在負轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白（repressor），起著阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的作用。根據(jù)其作用特征又可分為負控誘導(dǎo)和負控阻遏：在負控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，阻遏蛋白不與效應(yīng)物（誘導(dǎo)物）結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄；在負控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應(yīng)物（輔阻遏物）結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。第一百一十六頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五4、在正轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白（activator）。根據(jù)激活蛋白的作用性質(zhì)分為正控誘導(dǎo)和正控阻遏在正控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子（誘導(dǎo)物）的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)；在正控阻遏系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子（輔阻遏物）的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)。第一百一十七頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第一百一十八頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五四、轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的其他形式1、σ因子的更換在E.coli中,當(dāng)細胞從基本的轉(zhuǎn)錄機制轉(zhuǎn)入各種特定基因表達時，需要不同的因子指導(dǎo)RNA聚合酶與各種啟動子結(jié)合。第一百一十九頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五大腸桿菌中的各種σ因子比較σ因子編碼基因主要功能σ70rpoD參與對數(shù)生長期和大多數(shù)碳代謝過程基因的調(diào)控σ54rpoN參與多數(shù)氮源利用基因的調(diào)控σ38rpoH分裂間期特異基因的表達調(diào)控σ32rpoS熱休克基因的表達調(diào)控σ28rpoF鞭毛趨化相關(guān)基因的表達調(diào)控σ24rpoE過度熱休克基因的表達調(diào)控第一百二十頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五溫度較高,誘導(dǎo)產(chǎn)生各種熱休克蛋白由σ32參與構(gòu)成的RNA聚合酶與熱休克應(yīng)答基因啟動子結(jié)合,誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的熱休克蛋白,適應(yīng)環(huán)境需要枯草芽孢桿菌芽孢形成有序的σ因子的替換,RNA聚合酶識別不同基因的啟動子,使芽孢形成有關(guān)的基因有序地表達第一百二十一頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五五、反義RNA的調(diào)節(jié)反義RNA(AntisenseRNA):能與特異mRNA分子互補結(jié)合的一段RNA分子第一百二十二頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五反義RNA技術(shù)及作用原理反義RNA技術(shù)：利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建人工表達載體，使其離體或體內(nèi)表達反義RNA，從而抑制靶基因的表達。第一百二十三頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五反義RNA技術(shù)及作用原理反義RNA技術(shù)：作用原理:（1）復(fù)制水平：與引物RNA互補結(jié)合，抑制DNA復(fù)制。（2）轉(zhuǎn)錄水平：①與mRNA5′末端互補結(jié)合，阻止帽子結(jié)構(gòu)形成；②作用于外顯子和內(nèi)含子連接區(qū)，阻止前mRNA的剪接；③作用于polyA形成位點，阻止mRNA的成熟及其向胞漿中的轉(zhuǎn)運.（3）翻譯水平：可能是最主要方面，①互補于起始位點阻止核糖體結(jié)合；②互補于編碼區(qū)阻止核糖體在mRNA上移動；③降解靶mRNA第一百二十四頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第四章真核基因的表達與調(diào)控第一百二十五頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五真核生物的基因結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄活性真核生物轉(zhuǎn)錄機器的組成蛋白磷酸化對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控蛋白乙?；瘜虮磉_的影響第一百二十六頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)真核生物基因結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄活性基因家族真核基因的斷裂結(jié)構(gòu)活性染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)對轉(zhuǎn)錄的影響DNA甲基化與基因活性的調(diào)控第一百二十七頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五真核生物基因表達調(diào)控的特點和種類一、真核生物基因表達調(diào)控的特點1、RNA聚合酶真核生物有3種RNA聚合酶：RNApolⅠ、Ⅱ、Ⅲ。每種RNA聚合酶有約10個亞基組成，其中TATA盒結(jié)合蛋白（TBP）為3種酶共有。RNApolⅡ?qū)Υ呋痬RNA的生成起主要作用。轉(zhuǎn)錄前RNApolⅡ必須與TFⅡD等各種通用轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄前復(fù)合體（PIC），才能激活或抑制RNA的轉(zhuǎn)錄。第一百二十八頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五真核生物基因表達調(diào)控的特點和種類一、真核生物基因表達調(diào)控的特點2、多層次3、活性染色體結(jié)構(gòu)變化：對核酸酶敏感、DNA拓撲結(jié)構(gòu)變化、DNA堿基修飾變化、組蛋白變化4.轉(zhuǎn)錄與翻譯分隔進行5.轉(zhuǎn)錄后修飾、加工第一百二十九頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五一、基因家族（genefamily)真核生物的基因組中有很多來源相同、結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)的基因，將這些基因稱為基因家族。如：編碼組蛋白、免疫球蛋白和血紅蛋白的基因都屬于基因家族同一家族中的成員有時緊密地排列在一起，成為一個基因簇(genecluster)。第一百三十頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五二、斷裂基因基因的編碼序列在DNA分子上是不連續(xù)的，為非編碼序列所隔開，其中編碼的序列稱為外顯子，非編碼序列稱內(nèi)含子。外顯子(Exon)

：真核細胞基因DNA中的編碼序列，這些序列被轉(zhuǎn)錄成RNA并進而翻譯為蛋白質(zhì)。內(nèi)含子(Intron)

：真核細胞基因DNA中的間插序列，這些序列被轉(zhuǎn)錄成RNA，但隨即被剪除而不翻譯。第一百三十一頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五三、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與基因表達調(diào)控按功能狀態(tài)的不同可將染色質(zhì)分為活性染色質(zhì)和非活性染色質(zhì)，所謂活性染色質(zhì)是指具有轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)；非活性染色質(zhì)是指沒有轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)。第一百三十二頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五真核細胞中基因轉(zhuǎn)錄的模板是染色質(zhì)而不是裸露的DNA，因此染色質(zhì)呈疏松或緊密結(jié)構(gòu)，即是否處于活化狀態(tài)是決定RNA聚合酶能否有效行使轉(zhuǎn)錄功能的關(guān)鍵。第一百三十三頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五活性染色質(zhì)的主要特點在結(jié)構(gòu)上：活性染色質(zhì)上具有DNaseI超敏感位點活性染色質(zhì)上具有核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（MAR序列）第一百三十四頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五活性染色質(zhì)上具有DNaseI超敏感位點。每個活躍表達的基因都有一個或幾個超敏感位點，大部分位于基因5′端啟動子區(qū)域。完整的超敏位點是基因轉(zhuǎn)錄所必需的。第一百三十五頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第一百三十六頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五活性染色質(zhì)上具有核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（matrixattachmentregion

，MAR）。MAR一般位于DNA放射環(huán)或活性轉(zhuǎn)錄基因的兩端。在外源基因兩端接上MAR，可增加基因表達水平倍以10上，說明MAR在基因表達調(diào)控中有作用。是一種新的基因調(diào)控元件。第一百三十七頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第一百三十八頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第一百三十九頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五四、DNA的甲基化與基因調(diào)控：DNA的甲基化DNA的甲基化能關(guān)閉某些基因的表達，而去甲基化則誘導(dǎo)基因的重新活化和表達；DNA的甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA的穩(wěn)定性和DNA與蛋白質(zhì)的相互作用。第一百四十頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五CpG二核苷酸通常成串出現(xiàn)在DNA上，CpG島第一百四十一頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機理DNA甲基化導(dǎo)致某些區(qū)域DNA構(gòu)象變化，從而影響了蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，抑制了轉(zhuǎn)錄因子與啟動區(qū)DNA的結(jié)合效率。第一百四十二頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第一百四十三頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)真核生物轉(zhuǎn)錄機器的組成真核基因的轉(zhuǎn)錄增強子及其對轉(zhuǎn)錄的影響反式作用因子第一百四十四頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五“基因”的分子生物學(xué)定義：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。第一百四十五頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五1.啟動子順式作用元件：影響自身基因表達活性的非編碼DNA序列。例：啟動子、增強子、沉默子等（1）啟動子：在DNA分子中，RNA聚合酶能夠識別、結(jié)合并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄起始的序列。核心啟動子和上游啟動子元件（一）真核基因的轉(zhuǎn)錄第一百四十六頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五核心啟動子：指保證RNA聚合酶Ⅱ正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點和轉(zhuǎn)錄起始位點上游-30——-25處的TATAbox。上游啟動子元件：通常包括-70bp附近的CAATbox。（一）真核基因的轉(zhuǎn)錄第一百四十七頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（一）真核基因的轉(zhuǎn)錄2、轉(zhuǎn)錄模板3、RNA聚合酶Ⅱ4、RNA聚合酶Ⅱ所需要的轉(zhuǎn)錄因子第一百四十八頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五（二）增強子及其對轉(zhuǎn)錄的影響增強子是指能使與它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加的DNA序列。①

增強效應(yīng)明顯；②增強效應(yīng)與位置和取向無關(guān)；③大多為重復(fù)序列；④沒有基因?qū)Ｒ恍?，可以在不同基因組合上表現(xiàn)增強效應(yīng)；⑤許多增強子還受外部信號的調(diào)控，第一百四十九頁，共一百六十八頁，編輯于2023年，星期五