新西蘭兔脊髓內(nèi)水通道蛋白

新西蘭兔脊髓內(nèi)水通道蛋白【摘要】目的：探討正常新西蘭大白兔脊髓水通道蛋白4(AQP4)的定位與表達(dá)，為研究其在脊髓水代謝中的作用提供理論基礎(chǔ).方法：選用正常成年新西蘭大白兔，采用免疫組化和原位雜交技術(shù)檢測脊髓AQP4蛋白及其mRNA的定位及表達(dá).結(jié)果：免疫組織化學(xué)染色和原位雜交結(jié)果顯示膠質(zhì)細(xì)胞、前角運動神經(jīng)元、中央管室管膜細(xì)胞、軟脊膜上皮細(xì)胞均表達(dá)陽性，AQP4主要分布于細(xì)胞膜，其中，膠質(zhì)細(xì)胞和中央管室管膜細(xì)胞表達(dá)存在極性，前者主要分布在與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞接觸的一側(cè)，后者主要分布在中央管室管膜細(xì)胞的基底側(cè)膜.結(jié)論：AQP4在正常兔脊髓內(nèi)具有廣泛的表達(dá)，其表達(dá)的解剖定位提示AQP4在脊髓內(nèi)主要參與水分子的轉(zhuǎn)運及平衡調(diào)節(jié)、電解質(zhì)代謝，并受局部調(diào)節(jié)以適應(yīng)特殊的功能需求.

【關(guān)鍵詞】水孔蛋白4；兔；脊髓；免疫組織化學(xué)；原位雜交

0引言

水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一種疏水性膜蛋白家族，自1988年第一個AQP被發(fā)現(xiàn)［1］并于1997年正式命名為AQP1以來，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)11種之多.AQP廣泛存在于動、植物的細(xì)胞膜上，介導(dǎo)調(diào)節(jié)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運［2-3］.其中，AQP4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)最為豐富，研究證實其在腦內(nèi)主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞、軟腦膜、室管膜、脈絡(luò)叢以及下丘腦的視上核和室旁核等部位，參與了水分子的轉(zhuǎn)運及平衡調(diào)節(jié)、電解質(zhì)代謝和內(nèi)分泌活動［4］.但有關(guān)AQP4在脊髓的定位、表達(dá)和功能的研究有限，特別是在正常新西蘭大白兔脊髓的分布少見報道.為此，我們應(yīng)用免疫組化和原位雜交技術(shù)研究AQP4在新西蘭大白兔脊髓的定位，推測其可能的生理功能，并為AQP4在脊髓病態(tài)的表達(dá)提供有益的對比資料.

1材料和方法

材料成年健康新西蘭大白兔6只(河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，雌雄各3只，體質(zhì)量～kg.一抗為鼠抗AQP4多克隆抗體.SABC免疫組化試劑盒(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司).AQP4原位雜交檢測試劑盒(武漢博士德公司).

方法

標(biāo)本的制備在氯胺酮過度麻醉下剪開動物胸腔，經(jīng)心臟灌注生理鹽水500mL至流出液清亮后給予灌注40g/L多聚甲醛PBS緩沖液(pH)500mL.先快后慢，灌注固定后經(jīng)后正中切口、咬除棘突和椎弓根，取頸、胸、腰段脊髓各2小段，其中各脊髓節(jié)段1小段置入相同固定液中后固定24h用于免疫組化，剩余各脊髓節(jié)段置入相同固定液中后固定2h用于原位雜交.后固定成功后用蒸餾水清洗12h，逐級梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、4μm切片并裱于經(jīng)10g/L多聚賴氨酸處理的清潔載玻片，用于免疫組織化學(xué)和原位雜交檢測.

免疫組織化學(xué)檢測按免疫組織化學(xué)常規(guī)步驟進(jìn)行.切片于新鮮配制的30mL/LH2O2室溫浸泡10min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶；滴加正常山羊血清30min；滴加一抗抗人AQP4，37℃恒溫孵育2h,PBS洗；滴加二抗生物素化羊抗兔IgG室溫下30min，滴加試劑SABC，室溫30min；DAB顯色，室溫20min；脫水、透明，中性樹膠封片.染色對照：同一組片中分別用正常山羊血清和PBS代替AQP4一抗作孵育，其余步驟同上.

mRNA原位雜交按原位雜交檢測試劑盒說明書進(jìn)行.切片用40mL/L多聚甲醛(內(nèi)含1mL/LDEPC)固定30min后入3mL/LPBSH2O230min以除去內(nèi)源性過氧化物酶活性；然后胃蛋白酶37℃消化5min,40mL/L多聚甲醛終止反應(yīng)5min；每張切片滴加含2mg/LAQP4mRNA地高辛標(biāo)記探針的原位雜交液30μL，置濕盒中42℃雜交20h；分別用37℃預(yù)熱的2×SSS，0.1×SSS洗滌5min×3,10min×2；滴加小鼠抗地高辛抗體37℃2h,0.5mol/LTBS洗滌5min×3；滴加生物素化羊抗小鼠IgG37℃1h,0.5mol/LTBS洗滌5min×3；滴加ABS37℃30min.DAB顯色，脫水，透明，中性樹膠封片.陰性對照：分別用不含探針的雜交緩沖液取代含探針的雜交液及用正常羊血清取代羊抗地高辛抗體IgG進(jìn)行孵育.

2結(jié)果

免疫組化檢測在脊髓灰質(zhì)，AQP4陽性著色看起來彌散于整個神經(jīng)氈，只有神經(jīng)元胞質(zhì)不著色，細(xì)胞輪廓清楚.著色濃度最深的是位于后角的第I，Ⅱ板層，自背側(cè)向腹側(cè)存在著濃度梯度遞減的變化趨勢，到了中間帶和前角AQP4著色中等，但后角頸部的內(nèi)層部分，中央管周圍區(qū)域和胸段的中間外側(cè)柱著色仍深.在白質(zhì)，AQP4免疫陽性著色集中在起自灰質(zhì)并向脊髓表面放射的纖維膠質(zhì)突起上，主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起表達(dá)濃郁，或定向放射，或沿脊髓的外界和圍繞血管形成膠質(zhì)膜.脊髓軟脊膜上也呈陽性表達(dá).AQP4的分布除了較少差別外，在所有脊髓節(jié)段中均具有可比性并且呈粗略的線形分布.脊髓AQP4的陽性表達(dá)主要位于膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元的細(xì)胞膜上：灰質(zhì)內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞有強陽性著色，以細(xì)胞膜著色為主，脊髓前角運動神經(jīng)元胞膜也有陽性著色.中央管室管膜上皮細(xì)胞呈陽性表達(dá)，以靠細(xì)胞膜基底側(cè)較明顯，部分室管膜細(xì)胞呈較深的整個胞膜著色.脊髓白質(zhì)內(nèi)的纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞、脊髓表面軟脊膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜也呈強陽性表達(dá)，以鄰近蛛網(wǎng)膜下腔和面向毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)得尤為突出.膠質(zhì)細(xì)胞和中央管室管膜上皮細(xì)胞著色具有一定的極性分布，前者主要分布于與毛細(xì)血管接觸的一端，后者主要分布在靠近基底側(cè)處.上述分布現(xiàn)象在脊髓不同節(jié)段無明顯差異.

圖1新西蘭兔頸髓AQP4的表達(dá)SABC×16

圖2新西蘭兔脊髓白質(zhì)側(cè)素AQP4的陽性表達(dá)SABC×400

mRNA原位雜交檢測AQP4mRNA在脊髓神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá).在灰質(zhì)內(nèi)，神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)均有不同程度深色的棕色或棕褐色顆粒，未檢測到胞核中有雜交信號.其中，中央管室管膜細(xì)胞和位于后角的膠質(zhì)細(xì)胞均呈強陽性表達(dá).白質(zhì)內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞也呈強陽性表達(dá).

A：頸髓灰質(zhì)前角;B:脊髓中央管室膜細(xì)胞;C:脊髓側(cè)索中圍繞血管的星形膠質(zhì)細(xì)胞終足.

圖3新西蘭兔AQP4的表達(dá)SABC×400

A：脊髓前角灰質(zhì);B：脊髓后角灰質(zhì);C:脊髓白質(zhì)側(cè)索.

圖4新西蘭免AQP4mRNA的陽性表達(dá)DAB×200

3討論

由于脊髓生理功能的重要性，許多學(xué)者對AQP4在其中的分布進(jìn)行了研究，盡管發(fā)現(xiàn)AQP4在脊髓的表達(dá)分布于灰質(zhì)和鄰近脊髓血管上皮細(xì)胞的膠質(zhì)細(xì)胞的突起，但具體的神經(jīng)解剖定位未見報道［5-6］.我們應(yīng)用免疫組化及原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，AQP4在整個脊髓均有表達(dá)，包括神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，主要為細(xì)胞膜著色，特別是鄰近蛛網(wǎng)膜下腔和面向毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)得尤為突出.根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察，灰質(zhì)中AQP4表達(dá)陽性的膠質(zhì)細(xì)胞可能是原漿性星形細(xì)胞，白質(zhì)中者為纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞.灰質(zhì)AQP4密集著色大部分也源于其在圍繞毛細(xì)血管的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突的著色，并被免疫膠體金技術(shù)所證實［7］，有人認(rèn)為其參與形成血腦屏障［8］.Solenov等［9］證實了AQP4敲除小鼠脊髓后角深層的滲透膨脹比率明顯降低，而急性脊髓損傷水腫以灰質(zhì)最為突出，也就是說，AQP4的表達(dá)模式與脊髓水腫定位一致.表明AQP4在脊髓的水平衡中發(fā)揮了重要作用.

我們發(fā)現(xiàn)，AQP4表達(dá)的一個特點是位于脊髓組織－液體接觸的部位：即中央管室管膜上皮細(xì)胞和沿軟膜排列的膠質(zhì)細(xì)胞AQP4表達(dá)豐富，室管膜細(xì)胞的陽性著色主要位于基底側(cè)膜，這一發(fā)現(xiàn)與Rash等［10］所描述的大鼠脊髓室管膜免疫膠體金AQP4標(biāo)記一致.與其他上皮組織不同，室管膜細(xì)胞沒有基底膜，取而代之的為其下膠質(zhì)細(xì)胞的膠質(zhì)膜形成基底側(cè)膜.同樣的解剖結(jié)構(gòu)也存在脊髓表面的軟膜和神經(jīng)膠質(zhì)膜之間的連接.這些解剖特點提示AQP4在調(diào)節(jié)脊髓及其周圍腦脊液之間水的轉(zhuǎn)運可能起重要作用.我們還發(fā)現(xiàn)，分布于面向毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和軟脊膜側(cè)膠質(zhì)細(xì)胞和前角運動神經(jīng)元細(xì)胞膜上的AQP4在組織解剖分布上與K+通道相一致，Walz［11］和Nagelhus等［12］的研究資料也證實了相同極性分布現(xiàn)象.當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受到刺激產(chǎn)生動作電位時，細(xì)胞外間隙K+濃度將升高，升高的K+將被主要集中在膠質(zhì)細(xì)胞的足突膜上K+通道所分流，但K+的流動必將伴隨水分子的流動，以代償因K+流動所引起的滲透壓的變化.由此推測，AQP4可能在功能上參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外K+，水的代謝.

AQP4表達(dá)的另一個突出特點是脊髓灰質(zhì)呈明顯的板層差異性分布：后角最淺表的I，II板層表達(dá)最為強烈，而中間帶灰質(zhì)較弱，前角中等.這種板層分布的差異性并不能單純?yōu)樾切渭?xì)胞密度所解釋.例如，新皮層和海馬觀察到AQP4強度相當(dāng)，但后者星形細(xì)胞密度較高.可能原因有：①脊髓后角的I,II板層中的神經(jīng)元主要為中、小型細(xì)胞，胞體不足神經(jīng)元胞體的6%，其余為大量的樹突叢與膠質(zhì)細(xì)胞及其樹突叢，它們之間形成廣泛、密集的突觸聯(lián)系，AQP4著色也就最為強烈；②后角接受谷氨酸能神經(jīng)纖維的傳入，谷氨酸是傷害性和非傷害性初級傳入纖維、后角中間神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)，這些神經(jīng)纖維平時就進(jìn)行著大量較強而復(fù)雜的神經(jīng)電活動，局部細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)、水分子轉(zhuǎn)運活動頻繁，AQP4的需要量較大.即脊髓的板層樣AQP4表達(dá)可能受局部調(diào)節(jié)以適應(yīng)特殊的功能需求.總之，我們的研究提示，AQP4參與了脊髓水分子轉(zhuǎn)運及平衡調(diào)節(jié)、電解質(zhì)代謝，并且其表達(dá)受局部調(diào)節(jié)以適應(yīng)特殊的功能需求，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步研究.

【參考文獻(xiàn)】

［1］PrestonGM,CarrollTP,GugginoWB,etal.AppearanceofwaterchannelsinXenopusOocytesexpressingredcellCHIP28protein［J］.Science,1992,256(5055):385-387.

［2］苗新芳，戚好文，李志超.ANP對急性肺損傷大鼠AQP1表達(dá)的影響［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2003,24(24):2241-2243.

［3］汪泳，張方信，令曉玲，等.大鼠結(jié)腸中水通道蛋白4的表達(dá)與分布［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2004,25(2):142-143.

［4］KobayashiH,YanagitaT,YokooH,etal.Molecularmechanismsanddrugdevelopmentinaquaporinwaterchanneldiseases:aquaporinsinthebrain［J］.JPharmacolSci,2004,96(3):264-270.

［5］FrigeriA,GropperMA,UmenishiF,etal.LocalizationofMIWCandGLIPwaterchannelhomologsinneuromuscular,epithelialandglandulartissues［J］.JCellSci,1995,108(Pt9):2993-3002.

［6］RashJE,YasumuraT.Directimmunogoldlabelingofconnexinsandaquaporin4infreezefracturereplicasofliver,brain,andspinalcord:factorslimitingquantitativeanalysis［J］.CellTissueRes,1999(296):307-321.

［7］NielsenS,NagelhusEA,AmiryMoghaddamM,etal..Specializedmembranedomainsforwatertransportinglialcells:highresolutionimmunogoldcytochemistryofaquaporin4inratbrain［J］.JNeurosci,1997,17(1):171-180.

［8］NicoB,FrigeriA,NicchiaGP,etal.Severealterationsofendothelialandglialcellsinthebloodbrainbarrierofdystrophicmdxmice［J］.Glia,2003,42(3):235-251.

［9］SolenovEI,VetrivelL,OshioK,etal.Opticalmeasurementofswellingandwatertransportinspinalcordslicesfromaquaporinnullmice［J］.JNeurosciMethods,2002,113:85-90.