淺論厄多司坦對博萊霉素致大鼠肺纖維化發(fā)生發(fā)展的干預(yù)作用

淺論厄多司坦對博萊霉素致大鼠肺纖維化發(fā)生發(fā)展的干預(yù)作用【摘要】目的:探討厄多司坦對肺纖維化的干預(yù)作用及機制。方法:清潔級雄性SD大鼠24只，隨機分為2組：博萊霉素組12只，各組于造模后第7、28d行肺功能檢查后各處死6只，觀察肺泡炎和肺纖維化的動態(tài)變化和肺組織勻漿中羥脯氨酸、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。結(jié)果：①厄多司坦組大鼠肺泡炎、肺纖維化程度減輕，肺功能優(yōu)于博來霉素組。②28d時肺組織勻漿中HYP含量厄多司坦組顯著低于博來霉素組。③7d時肺組織勻漿中MDA、MPO含量厄多司坦組顯著低于博來霉素組，厄多司坦組SOD活力高于博來霉素組，28d時上述各指標(biāo)兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(）。結(jié)論：①厄多司坦對博萊霉素致大鼠肺纖維化有干預(yù)作用，②厄多司坦干預(yù)肺纖維化的機制早期可能為通過使中性粒細胞扣壓減少,增加自由基的清除使體內(nèi)氧化抗氧化系統(tǒng)恢復(fù)平衡,使脂質(zhì)過氧化損傷減輕而實現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】肺纖維化；厄多司坦；羥脯氨酸；自由基；博萊霉素；大鼠

【ABSTRACT】Objective:Toinvestigatethepossibleeffectandunderstandmechanismsoferdosteineinpulmonary:24SpragueDawleymaleratsweighting250±10gwererandomlydividedintotwogroups:BLMgrouptwelverats(LungfibrosiswasinducedbyintratrachedinjectionofBLMA55mg/kg，～)、erdosteinegrouptwelverats，andpulmonaryfunctionoferdosteinegroupratswassurpassivesignificantlyinBLMgroup.②Atthe28thdayinerdosteinegroupthecontentofHYPinlungtissuewaslowersignificantlythanthatofcorrespondingBLMgroup.③Atthe7thdayinerdosteinegroupthecontentofMDA、MPOinlungtissuewaslowersignificantlythanthatofcorrespondingBLMgroup、andtheactivityofSODinlungtissue(U/mgprot)washighersignificantlythanthatofBLMgroup,butAt28thdaytherewasnostatisticdifference(）Conclusion:①ErdosteinecancureBleomycininducedpulmonaryfibrosisinrats.②ThepossibleunderliningmechanismsthatErdosteinecureBleomycininducedpulmonaryfibrosisinratsmaydecreaseneutrophileaccumulation,balaceoxidationantioxidationsystembyreducingfreeradicalproductionandincreasingfreeradicalremove,toalleviatelipidperoxidationdamage.

【KEYWORDS】PulmonaryFibrosis,Erdosteine,Hydroxyproline,FreeRadicals,Bleomycin,Rats

肺間質(zhì)纖維化。隨機分為2組,博萊霉素組：12只，制造肺纖維化模型，大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，無菌條件下經(jīng)頸手術(shù),暴露氣管，經(jīng)環(huán)甲軟骨下氣管間隙穿刺，一次性緩慢注入～含BLMA5(5mg/kg,用生理鹽水配成濃度為4mg/L)的生理鹽水溶液，注射后立即將大鼠直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布均勻，縫合切口，覆蓋紗布，動物自然清醒后以生理鹽水灌胃，直至處死。厄多司坦組：12只，用同法制造肺纖維化模型后以厄多司坦灌胃，直至處死，各組于造模后第7、28d各處死6只。各組及各時間點的動物處死前均先行肺功能檢查。

動物肺功能檢查方法

以10%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉動物后，將其固定在木板上，在無菌操作下做頸部正中切口，充分暴露氣管，并下穿手術(shù)線待固定氣管插管。在氣管下段做一小“T”形切口，將自制的氣管插管固定于氣管內(nèi)，然后將麻醉大鼠放入體描箱中，打開肺功能儀各開關(guān)，調(diào)整各項參數(shù)到備用狀態(tài)后，將氣管插管與體描箱中的導(dǎo)管聯(lián)通，關(guān)閉體描箱，行肺功能檢查，檢查完畢后保存各項數(shù)據(jù)，待分析肺功能指標(biāo)：肺活量、肺順應(yīng)性。然后將大鼠移出體描箱，放在木板上待取標(biāo)本。

試劑與儀器

博來霉素A5粉劑：天津太河制藥廠生產(chǎn)。

厄多司坦片：揚子江藥業(yè)集團公司生產(chǎn)。

SOD、MDA、MPO、HYP測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

動物肺功能分析系統(tǒng)：購于北京貝蘭博科技公司。

可見分光光度計722：上海分析儀器廠。

標(biāo)本的留取及處理

動物行肺功能檢查完畢后，心臟穿刺取血處死。取右肺中葉置于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定24h，之后常規(guī)石蠟包埋，切片，進行HE染色和Masson染色，光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化，左肺葉冷生理鹽水漂洗后立即剪成小塊,用手動勻漿儀碾成勻漿,置于-70℃冰箱中保存，待測定MDA、MPO、HYP的含量。

2009年6月張蕾等：厄多司坦對博萊霉素致大鼠肺纖維化發(fā)生發(fā)展的干預(yù)作用第3期2009年6月河北北方學(xué)院學(xué)報第3期肺泡炎、肺纖維化程度分級

根據(jù)Szapiel等的方法，在光鏡下觀察HE染色和Masson染色病理切片分別評價肺泡炎和肺纖維化的程度，均分為4級。肺泡炎分級：0級：無肺泡炎；1級：輕度肺泡炎，肺泡隔因細胞浸潤增寬，病變范圍局限在全肺20%以下，肺泡結(jié)構(gòu)正常；2級：中度肺泡炎，病變范圍占全肺的20%～50%；3級：重度肺泡炎，成彌漫性分布，病變范圍大于50%。肺纖維化分級：0級：無肺纖維化；1級:輕度肺纖維化，受累面積少于全肺20%；2級:中度肺纖維化，受累面積占全肺的20%～50%，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂；3級：重度肺纖維化，受累面積大于50%，肺泡融合，肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂。

統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)資料采用統(tǒng)計軟件處理。實驗結(jié)果中計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；同一時間點組間比較采用t檢驗；病理等級資料采用非參數(shù)秩和檢驗,以認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

一般情況觀察

博來霉素組大鼠很快出現(xiàn)精神不振，被毛干枯無光澤，少動，進食少，體重減輕，唇及爪輕度紫紺，第5d死亡一只，約14d后食欲和體重有改善；厄多司坦組大鼠精神狀態(tài)、進食、活動較博來霉素組好，無死亡，體重增長基本正常。

肺臟病理組織學(xué)改變

根據(jù)Szapiel等的方法，博來霉素組：7d時肺泡炎性改變明顯，HE染色可見肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)有大量炎性細胞浸潤，以巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞為主，肺泡間隔增寬，伴有水腫和出血。Masson染色見肺泡間隔增寬明顯，膠原纖維增多，肺泡結(jié)構(gòu)改變。28d時，肺泡炎癥減輕，但間質(zhì)內(nèi)仍有巨噬細胞浸潤，成纖維細胞大量聚集，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，間隔增寬，并且炎癥、纖維化、肺泡出血并見；Masson染色見大量膠原纖維呈束狀或者片狀沉積，肺泡壁變厚，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。厄多司坦組各時間點與博來霉素組比較表現(xiàn)出基本一致的變化規(guī)律，但肺泡炎和纖維化的程度較輕，半定量統(tǒng)計結(jié)果有顯著差異性。各組大鼠肺泡炎和肺纖維化的Szapiel分級見表1。圖1博來霉素組大鼠肺組織病理切片(HE染色×400）圖3博來霉素組大鼠肺組織病理切片(Masson染色×400）圖2厄多司坦組大鼠肺組織病理切片(HE染色×400）圖4厄多司坦組大鼠肺組織病理切片(Masson染色×400）表1兩組大鼠肺泡炎、肺纖維化分級注：厄多司坦組與同時間點博來霉素組相比*

肺組織中HYP含量的變化

肺組織勻漿中HYP含量:7d時博來霉素組與厄多司坦組HYP含量分別為±、±，兩組相比無顯著性差異，28d時博來霉素組與厄多司坦組HYP含量分別為±、±，厄多司坦組較博來霉素組減低(見圖5）。兩組大鼠HYP含量比較。

圖5兩組大鼠HYP含量比較肺功能指標(biāo)變化

肺活量。

圖6兩組大鼠肺活量比較圖7兩組大鼠肺順應(yīng)性比較肺順應(yīng)性(mL/cmH2O):7d時博來霉素組與厄多司坦組分別為±、±，兩組相比無顯著性差異，28d時博來霉素組與厄多司坦組分別為±、±，博來霉素組明顯低于厄多司坦組。

肺組織勻漿中SOD活力(u/mgprot):7d時博來霉素組與厄多司坦組分別為±、±，博來霉素組較厄多司坦組明顯減低。28d時博來霉素組與厄多司坦組分別為±、±，兩組相比無顯著性差異。

圖8兩組大鼠SOD活力比較肺組織勻漿中MDA含量:7d時博來霉素組與厄多司坦組分別為±、±，博來霉素組明顯高于厄多司坦組。28d時博來霉素組與厄多司坦組分別為±、±，兩組相比無顯著性差異。

圖9兩組大鼠MDA含量比較肺組織勻漿中MPO含量(u/gprot):7d時博來霉素組與厄多司坦組分別為±、±，厄多司坦組低于博霉素組，28d時博來霉素組與厄多司坦組分別為±、±，兩組相比無顯著性差異。

3討論

肺纖維化動物模型的評價

對于實驗研究而言，復(fù)制合理、穩(wěn)定的疾病動物模型是研究該疾病發(fā)病機制及藥效機理的重要環(huán)節(jié)。而對本實驗來講，就是要復(fù)制符合臨床情況的肺纖維化大鼠模型。本實驗采用氣管內(nèi)一次性滴注博來霉素的給藥方法制作肺纖維化大鼠模型。BLM是臨床常用的抗腫瘤藥物，其主要的毒副作用之一是引起肺纖維化，用其復(fù)制的動物肺纖維化模型，病理組織學(xué)和生理學(xué)改變與人類肺纖維化近似，其病理特點為早期肺泡炎導(dǎo)致肺損傷以及其后的彌漫性纖維化，許多細胞因子的表達、肺功能及血氣分析的改變都與人類肺纖維化的變化相一致，因此已被廣泛用于模擬肺纖維化發(fā)生過程，研究發(fā)病機制及篩選藥物。其中支氣管灌注BLM復(fù)制肺纖維化模型的方法可靠、給藥劑量小、容易掌握，已成為國內(nèi)外公認的成熟方法。本實驗結(jié)果表明，博來霉素組大鼠滴注BLM7d后，肺損傷表現(xiàn)以肺泡炎為主，大量炎性細胞浸潤，第28天可見較明顯的纖維結(jié)締組織增生，膠原沉積，肺泡結(jié)構(gòu)破壞或消失，病損范圍廣泛，肺纖維化形成。這些病理改變與文獻報道一致，提示本實驗動物模型的復(fù)制成功。

厄多斯坦干預(yù)肺間質(zhì)纖維化的療效評價

厄多司坦對肺纖維化是否具有干預(yù)作用？肺病理形態(tài)的改變和肺功能是最為直觀的療效衡量標(biāo)準(zhǔn)，HYP含量被認為是間接反映膠原含量的敏感指標(biāo)，可以判斷纖維化的程度，本實驗結(jié)果顯示：厄多司坦組與博萊霉素組相比肺泡炎和肺纖維化程度減輕，病理半定量結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異；肺活量和肺順應(yīng)性升高；28d時HYP含量顯著下降，提示厄多司坦對肺纖維化有積極的干預(yù)作用，它的作用可能在于抑制肺泡炎的發(fā)展，并抑制膠原沉積，進而減輕了纖維化的程度，減緩了疾病的進程。

厄多司坦干預(yù)肺纖維化的可能機制

盡管肺纖維化的發(fā)病機制尚不完全清楚，但越來越多的證據(jù)表明氧化—抗氧化失衡、復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)之間的相互作用在肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用?；钚匝踉诜谓M織內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生并具有生理作用,正常肺組織內(nèi)存在完整的氧化—抗氧化體系,如SOD，能及時調(diào)節(jié)和清除自由基。肺臟發(fā)生疾病時,體內(nèi)自由基增加,患者機體為了捕捉和清除這些過量的自由基以恢復(fù)氧化—抗氧化的動態(tài)平衡,就必然消耗大量的SOD、從而導(dǎo)致SOD含量顯著降低。因此測定SOD活力的高低，間接反映機體SOD過量消耗及機體清除氧自由基的能力不足。當(dāng)氧自由基過量時,OFR能攻擊生物膜中的多價不飽和脂肪酸,引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用,形成脂質(zhì)過氧化物,MDA是主要的產(chǎn)物之一,因而測試MDA的量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,間接地反映體內(nèi)自由基生成的情況及反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。本實驗結(jié)果顯示：在兩組大鼠中，SOD活力、MDA活力于造模7d時有差異，而造模7d時正是肺泡炎的高峰期，說明自由基可能通過肺泡炎對肺纖維化的形成發(fā)揮作用。在7d時厄多司坦組較博萊霉素組：SOD活力顯著升高，MDA活力顯著降低，說明厄多司坦可以通過提高SOD活力而增強肺局部的抗氧化能力，減輕肺泡炎，抑制脂質(zhì)過氧化損傷，進而抑制肺纖維化的形成。MPO是中性粒細胞的一種特異性含氯溶酶體酶,主要存在于PMN嗜天青顆粒中,其含量的多少與PMN的數(shù)目成正比,是其扣壓的指標(biāo)。在有鹵素離子存在時,MPO能清除PMN吞噬過程中釋放的H2O2產(chǎn)生次氯酸離子(HClO-)。HClO-可氯化氨基基團,造成肽鏈斷裂,形成小分子胺,破壞許多生物分子及細胞膜,損害機體防衛(wèi)系統(tǒng);能夠攻擊細胞膜,引起NAD+和ATP的耗竭,損傷細胞的結(jié)構(gòu)和功能。本實驗結(jié)果顯示：厄多司坦組較博萊霉素組MPO活力顯著降低，說明厄多司坦通過使中性粒細胞扣壓減少，進而減輕肺損傷，從而抑制肺纖維化的形成。

由上可見，體內(nèi)氧化—抗氧化失衡在肺纖維化形成過程中發(fā)揮重要作用。厄多司坦對博萊霉素致大鼠肺纖維化有干預(yù)作用，其早期可能的機制是通過減少中性粒細胞扣壓,減少其呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的自由基,增加自由基的清除使體內(nèi)氧化—抗氧化系統(tǒng)恢復(fù)平衡,從而使脂質(zhì)過氧化損傷減輕實現(xiàn)的。

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