微生物來源的具有促進纖溶作用的低分子化合物的研究進展

微生物來源的具有促進纖溶作用的低分子化合物的研究進展【摘要】歸納了纖溶酶原的空間結(jié)構(gòu)和纖溶酶原的活化在血栓溶解上的重要作用，分析了低分子化合物通過改變纖溶酶原空間結(jié)構(gòu)促進血栓溶解的機理。重點敘述了到目前為止發(fā)現(xiàn)的complestatin,chloropeptinⅠ,stablabin,sarfuctin,glucosyldiacylglycerol等幾類具有促進纖溶作用的低分子天然化合物和它們各自的特性，并且敘述了這些化合物促進纖溶作用的機制。

【關(guān)鍵詞】纖溶酶原；纖溶作用；低分了化合物

Reviewoflowmolecularweightcompoundsfromthemicrobialmetabolitesthatenhancingfibrinolysis

【Abstract】Thepaperintroducesfibrinolyticsystem,structureandactivationofplasminogenwithemphasisonthelowmolecularbiosubstancesfounduptonowanddiscussingtheirmechanismofenhancingfibrinolysis.

【Keywords】plasminogen;fibrinolysis;lowmolecularweightcompounds

纖溶系統(tǒng)具有溶解血栓的作用，此外它還與創(chuàng)傷治療、組織再建、血管新生、炎癥反應、排卵、癌的形成與轉(zhuǎn)移、動脈硬化、病原菌的組織侵入等許多生理的、病理的變化過程相關(guān)［1，2］，纖維蛋白原是血液中的重要構(gòu)成蛋白質(zhì)，正常血漿的含量在2～4g/L，纖維蛋白原由3種線狀的糖蛋白分子所構(gòu)成，蛋白質(zhì)長鏈通過二硫鍵結(jié)合在一起形成分子量為34萬的纖維蛋白原大分子，以溶解狀態(tài)參與血液循環(huán)，通過血液凝固反應，在凝血酶的作用下纖維蛋白原能被轉(zhuǎn)變成不溶的纖維蛋白沉積在血管壁上。纖溶系統(tǒng)的纖溶酶原和纖溶酶原激活劑通過賴氨酸結(jié)合位點與纖維蛋白相結(jié)合，在該結(jié)合部位形成的纖溶酶將纖維蛋白分解，纖溶酶原被兩種纖溶酶原激活劑促進非活化狀態(tài)的纖溶酶原向活化的纖溶酶的轉(zhuǎn)化；提高纖溶酶原的血栓結(jié)合活性；改變纖溶酶原的空間結(jié)構(gòu)使該酶原處于容易被纖溶酶原激活劑活化的狀態(tài)；促進血液中微量存在的尿激酶型纖溶酶原激活劑前體酶解反應過程，血管中因病理作用生成的血栓將被溶解并進而消除血栓癥。從天然化合物中探索針對于纖溶體系的酶原、酶的特異性生理活性物質(zhì)作為血栓癥的治療藥物將不存在生理性的出血危險性，并且會適用于慢性及早期血栓癥狀。基于上述事實和理論基礎，利用纖溶體系的酶原［3，18］與存在于第5個鏈回環(huán)上的氨基已糖結(jié)合位點形成分子內(nèi)結(jié)合鍵所維持［5，6］，當?shù)?個鏈回環(huán)上的氨基已糖結(jié)合位點與纖維蛋白相結(jié)合時，NTP-K5的相互作用被解除，纖溶酶原分子被轉(zhuǎn)變成開放型的結(jié)構(gòu)，纖溶酶原分子在空間馳豫，從而裸露在纖維蛋白表面的賴氨酶殘基與纖溶酶原上顯露出來的賴氨酸結(jié)合位點結(jié)合后，在空間馳豫的纖溶酶原被結(jié)合到纖維蛋白表面，纖溶酶原進一步被存在于其附近的組織型纖溶酶原激活劑，在纖維蛋白上，纖溶酶原的活性表現(xiàn)出是局域性的，血栓溶解最先開始于賴氨酸殘基的周圍，其作用機理如圖2所示。另外，隨著纖溶的進行，Glu-Plg的N末端短肽被絲氨酸蛋白酶纖溶酶所切斷，Lys78-plasminogen(Lys-Plg)在纖溶酶所出現(xiàn)的區(qū)域產(chǎn)生，Lys-Plg分子由于不帶有NTP-K5分子內(nèi)結(jié)合鍵，所以是開放型構(gòu)造，容易活化，并且通過高親和性與纖維蛋白結(jié)合。低分子化合物ε-氨基已酸，這是由于介于纖溶酶原鏈回環(huán)上的賴氨酸結(jié)合位點的Glu-Plg-纖維蛋白復合物的形成被阻抑了。在纖維蛋白溶解反應的局域性和纖溶反應的高效性上，血液中的Glu-Plg與纖維蛋白的結(jié)合以及由此帶來的空間結(jié)構(gòu)的變化發(fā)揮著重要的作用。纖溶酶原是由791個氨基酸構(gòu)成的單鏈糖蛋白，構(gòu)成糖約占分子量的2%。從N末端開始順次分為N末端短肽結(jié)構(gòu)域成雙鏈的纖溶酶，PAC端的B鏈。

圖中圓圈和其中的字母表示具體的氨基酸及其位置：數(shù)字表示從N末端起始的氨基酸序列：實心箭頭表示彈性蛋白酶、胃蛋白酶、絲氨酸蛋白酶活性中心結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，在K1、K2、K4、K5存在賴氨酸結(jié)合位點，K5的賴氨酸結(jié)合位點由于也能識別氨基已糖，所以又稱作氨基已糖結(jié)合位點，能結(jié)合肽鏈中的賴氨酸。Glu-Plg分子的NTPLys50(或Lys62)在K5的AH位點上形成分子內(nèi)結(jié)合鏈，維持著緊密的空間結(jié)構(gòu)，對活化作用顯示出抵抗性。通過K5與纖維蛋白或細胞受體的結(jié)合，以及纖溶酶切斷NTP，都會使纖溶酶原的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生馳豫，從而感受到PA的活性化。

2促進纖溶作用的化合物

到目前為止，主要的纖溶促進化合物的特性被歸納在表1，這些化合物的探索途徑、分離純化和纖溶促進機制分述如下。圖3促進纖溶作用的低分子天然化合物表1具有纖溶促進作用化合物的特性注：-沒有實驗數(shù)據(jù)；*含有不同于纖溶酶原作用特點的特征

complestatin和chloropeptin1以纖溶酶原和纖溶酶原受體構(gòu)成invitro檢索體系，用于探索促進纖溶酶原向受體結(jié)合的低分子天然化合物。認為促進纖溶酶原向纖溶酶原受體結(jié)合的化合物也會促進纖溶酶原和纖維蛋白的結(jié)合，進而促進血栓的溶解。以U937細胞作為纖溶酶原受體的供體，使用人纖溶酶原構(gòu)成了纖溶促進化合物的檢索體系，在對約5000株微生物的代謝產(chǎn)物進行篩選的基礎上，從鏈霉菌屬complestatin和chloropeptin1［7,8］促進了纖溶酶原向U937纖溶酶原受體的結(jié)合。該化合物是從土壤的分離菌株中分離純化的，將活化培養(yǎng)的種子液接種到由可溶性淀粉3%、肉膏1%、混合溶液%、玉米浸出汁2%和消泡劑CB442%構(gòu)成的液體培養(yǎng)基中，在25℃、310rpm的條件下連續(xù)培養(yǎng)3天，收獲的菌絲用70%丙酮溶液提取，提取物用乙酸乙酯萃取，萃取物經(jīng)丙酮-甲醇硅膠層析后，活性化合物被移動相為含%三氟醋酸的45%乙氰水溶液的高壓液相色譜柱具有顯著的促進纖溶作用，該化合物分離于土壤微生物StachybotrysMicrospora的一個菌株。將經(jīng)過種子培養(yǎng)的菌株接種到1L培養(yǎng)液含30g葡萄糖、10g脫脂豆粉、3g肉膏、3g酵母粉、3g蛋白粉、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂和消泡劑CB442的培養(yǎng)基中，在25℃、180rpm用500ml三角瓶連續(xù)培養(yǎng)3～5天，培養(yǎng)液離心后，上清液用等量的2-丁酸抽提，抽提物用二氯甲烷和甲醇展開于硅膠層析柱，活性成分被InertsilSIL-ODS精制，移動相是流速為/min的乙烷和乙醇的混合溶液。

300～500μM的staplabin使Glu-Plg和Lys-Plg與纖維蛋白的結(jié)合增加了，這種增加依賴于Glu-Plg和Lys-Plg上的賴氨酸結(jié)合位點，并且在纖溶酶原激活劑存在下，Glu-Plg和Lys-Plg的活化被促進了，所以體現(xiàn)出提高了纖溶酶的分解活性［13］，在使用分子排除層析的實驗上由于該化合物部分地縮短了Glu-Plg和Lys-Plg的溶出時間，所以被認為該化合物使這些分子馳豫。纖溶酶原活性化的促進作用在ε-氨基已酸也顯示出同樣的作用，但是SMTP-6、SMTP-7、SMTP-8與staplabin相比活性增加了3～10倍。

環(huán)肽化合物在血漿存在下，利用U937細胞，探索促進125I-纖維蛋白分解的促進物質(zhì)時，發(fā)現(xiàn)了4種新型物質(zhì)plactins［14］。

在和50種合成誘導物比較之后，發(fā)現(xiàn)plactins的D-Arg(或D-Lys)殘基和4個疏水殘基的立體配置構(gòu)型是顯示活性所必需的結(jié)構(gòu)［15］。20～50μM的plactin介于血漿中的因子將細胞表面的單鏈的尿激酶前體轉(zhuǎn)變成活化型的雙鏈結(jié)構(gòu)，而開始了纖溶反應。該活化機制比較復雜，介于多個因子的多條途徑引起了促進纖溶作用。將Plactin～5mg/kg投于肺栓塞小鼠，小鼠栓塞肺的纖溶活性被促進了2～3倍。在uPA存在下，40～60μM的plactin使Glu-Plg的活化被提高了10倍，并且plactins使Glu-Plg的內(nèi)部熒光增加了5%，但plactins對Lys-Plg的活性沒有影響。與前述的化合物不同，plactin沒有增加Glu-Plg與纖維蛋白的結(jié)合。該化合物在血漿/U937細胞體系將纖維蛋白的分解提高了3～4倍，但在Glu-Plg/U937細胞體系和Glu-Plg/uPA體系，沒有促進纖維蛋白的分解，這暗示著plactin的促進纖溶作用依賴于Glu-Plg以外的通路。

脂蛋白。

從土壤分離到的一株枯草芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物被檢索出來具有促進纖溶作用，將該菌株用普通細菌培養(yǎng)基在28℃、180rpm連續(xù)培養(yǎng)5天后，將培養(yǎng)液用2-丁醇提取后，提取物用乙氰-%乙酸展開于高壓液相色譜柱InertsilPREP-ODS上，活性成分經(jīng)濃縮和凍結(jié)干燥后得到了脂蛋白surfactin。

3～10μM的surfactinC使纖溶酶原和尿激酶前體的轉(zhuǎn)換被提高了3～4倍，這種促進作用是由于surfactinC促進了尿激酶引起的Glu-Plg的活化。SurfactinC也促進了Lys-Plg的活化，但surfactinC不影響mini-Plg的活化，在ε-氨基乙酸存在下也不影響Glu-Plg的活化，這個結(jié)果暗示著surfactinC作用于纖溶酶原鏈回環(huán)的K1、K2、K3、K4中的某個或某幾個結(jié)構(gòu)域，因為ε-氨基已酸作用于纖溶酶原鏈回環(huán)的K5結(jié)構(gòu)域，而不影響纖溶酶原鏈回環(huán)的K1、K2、K3、K4結(jié)構(gòu)域。surfactinC使Glu-Plg的內(nèi)部熒光增加了%，有分子排除層析實驗上使Glu-Plg的溶出時間縮短，從這些結(jié)果上能判斷Glu-Plg的空間結(jié)構(gòu)被馳豫了。該化合物促進了Glu-Plg和纖維蛋白的結(jié)合，在pro-uPA/Glu-Plg,uPA/Glu-Plg,uPA/血漿體系促進了纖溶作用。該化合物的促進纖溶作用。將干燥的褐藻添加到三氯甲烷和甲醇的混合有機溶劑中，用組織搗碎機充分破碎，過濾之后回收濾液，針對殘渣重復一次上述的提取過程，再用提高了溶劑極性的混合液提取殘渣中的可溶性物質(zhì)。把三次提取的濾液混合，經(jīng)減壓濃縮和真空干燥，從褐藻中得到了粗提取物，該粗提物經(jīng)3次柱層析后得到了精制的生物活性物質(zhì)α-D-葡萄糖甘油二酯。

相當?shù)蜐舛鹊钠咸烟歉视投ンw現(xiàn)出來，這被認為是機體進化的一個方面。纖溶酶原是這種變化過程的一個典型，發(fā)現(xiàn)的這些具有促進纖溶作用的化合物使纖溶酶原的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生微妙的變化從而促進了纖溶作用。從以上的這些事實還能夠進一步推測纖溶因子如纖溶酶、尿激酶、尿激酶前體的活性化合物也會促進血栓纖維蛋白的溶解，并且纖溶系統(tǒng)抑制因子的抑制化合物也會促進血栓纖維蛋白的溶解。

溶血鏈球菌產(chǎn)生的鏈激酶等細菌的代謝產(chǎn)物和纖溶系統(tǒng)的關(guān)系從很早以前就知道了，最近又從侵染性的多種病原菌中發(fā)現(xiàn)了纖溶酶原的受體［2］，這些受體被認為與病原性細菌的侵入和組織侵入有關(guān)。與這些受體蛋白質(zhì)相比較，上述敘述的化合物是低分子化合物，這些低分子化合物來自于細菌、放線菌、霉菌和海洋生物，作用于纖溶酶原或是尿激酶前體。產(chǎn)生這些化合物的生產(chǎn)菌和高等動物的關(guān)系如何？雖然目前的材料還不充分，但這些化合物的存在也讓研究者能進一步探索這些化合物在病原菌侵染、組織纖溶、癌細胞游走和血栓疾病治療上的巨大價值。

被應用于纖溶療法上的酶或高分子蛋白如尿激酶、tPA等，主要是應用于心肌梗塞等重度血栓疾患的治療上，它會帶來全身出血的重大危險性，與此相對應，作用于纖溶酶原和尿激酶前體的低分子化合物會使生理的纖溶反應平穩(wěn)的進行，特別適用于慢性疾患的治療以及血栓疾病的前期，這些化合物正被人們期待著能成為安全、高效的血栓治療藥物。

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