注射用葛根素納米乳的制備及質(zhì)量評價

注射用葛根素納米乳的制備及質(zhì)量評價【摘要】目的研制注射用葛根素納米乳。方法采用單因素篩選，通過相優(yōu)化制備工藝，并對葛根素納米乳的理化性質(zhì)、形態(tài)和粒徑分布、含量等質(zhì)量指標進行考察。結(jié)果最適宜的油相、表面活性劑和助表面活性劑分別為大豆油、磷脂和山梨醇，三者之間的最適比例為∶20∶20。以優(yōu)化處方和工藝制備的注射用葛根素納米乳的含量為％，外觀呈淺黃色，透明，乳滴呈球形，平均粒徑為nm，粒徑分布較窄，電導(dǎo)率為69μs·cm-1，粘度為mPa·s，折光率為，穩(wěn)定性較好。結(jié)論成功地研制了具有較好質(zhì)量指標的葛根素納米乳，為注射用葛根素納米乳進一步研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】葛根素納米乳偽三元相圖質(zhì)量評價

Abstract：ObjectiveTostudynanoemulsionofpuerarinforinjection.MethodsSinglefactorscreeningandphasediagramwereusedtooptimizepreparationprocess,andphysicochemicalproperties,shape,size,sizedistributionandcontentofpuerarinnanoemulsionswereoil,surfactantandcosurfactantweresoybeanoil,phospholipaseandsorbitolwiththroptimumproprotionof∶20∶20.Thepuerarinemulsionforinjectionhad%puerarin,andappearedyellow,transparent.Dropletsinemulsionsshowedsphericalwithaveragesizenm,conductivity69μs·cm-1,viscositymPa·s,refractiveindexandgoodnanoemulsionsweredevelopedsuccessfully.

Keywords：Puerarin;Nanoemulsion;Pseudo-ternaryphasediagram;Qualityevaluation

葛根素是于20世紀90年代中期上市的國家中藥一類新藥，對心腦血管疾病具有確切的療效，但其水溶性差、口服難吸收、血漿半衰期短、生物利用度低，加之近年來對葛根素注射液的不良反應(yīng)亦有較多報道［1］，這些不足限制了葛根素的臨床應(yīng)用［2，3］。納米乳是近年來起來的一種新型給藥系統(tǒng)，能夠增加難溶性藥物的溶解度、促進藥物經(jīng)胃腸道吸收或透皮吸收、延長藥物釋放時間、減輕注射疼痛和其他不良反應(yīng)，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男滦徒o藥系統(tǒng)。鑒于此，本文以納米乳為給藥載體，以葛根素為模型藥物，研制注射用葛根素納米乳，以提高葛根素的臨床療效，降低毒副作用。

1藥品與儀器

注射用葛根素，四川巨邦植物藥有限公司產(chǎn)品；注射用豆磷脂上海太偉產(chǎn)品；花生油、大豆油，市售，經(jīng)精制；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV-2450紫外-可見分光光度計，島津產(chǎn)品；DV-1數(shù)字式粘度計，上海倫捷機電儀表有限公司產(chǎn)品；DDS-11A型數(shù)字式電導(dǎo)率儀，上海偉業(yè)儀器廠產(chǎn)品；納米型激光粒度儀A22NanoTecFritsch；2W阿貝折光儀，上海光學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

2方法與結(jié)果

葛根素在不同油相中的溶解度將過量的葛根素原料藥分別置于2g的花生油、大豆油、液狀石蠟中，渦旋混勻h，37℃振蕩24h，以達平衡，再以4000r·min-1離心，取上清液適量，測得葛根素的溶解度依次為，，mg·g-1。由實驗結(jié)果可知，葛根素在大豆油中的溶解度最大，故可以考慮選擇大豆油作為制作葛根素納米乳的油相。

表面活性劑的篩選葛根素在大豆油中的溶解度最大，但僅靠油相溶解不能滿足臨床給藥劑量，所以必須選擇對葛根素增溶能力強的表面活性劑。等研究表明，形成ME的最佳HLB值在11～15之間，濃度適中，形成的粒徑較小。本文選用了藥劑學(xué)上常用的3種非離子表面活性劑泊洛沙姆188、乳化劑OP和磷脂。測定方法為：分別將過量的葛根素原料藥置于泊洛沙姆188、乳化劑OP、磷脂的膠束水溶液中，渦旋混勻，37℃振蕩24h，以達平衡。以4000r·min-1離心20min，取上清液適量，測得葛根素的溶解度依次為，，mg·g-1。由實驗結(jié)果可知，葛根素在磷脂中的溶解度最大，故選取磷脂作為研制葛根素納米乳的表面活性劑。

油相和助表面活性劑的篩選將磷脂分別與助表面活性劑無水乙醇、1,2-丙二醇、PEG400﹑山梨醇按重量比Km=1∶1配成相同濃度的膠束溶液10ml，磷脂與助表面活性劑濃度各為g·ml-1，均分3份，每份膠束溶液分別滴入油相花生油、大豆油、液狀石蠟中形成體系，渦旋，以澄清度為指標，觀察各體系的變化。結(jié)果表明，只有以大豆油為油相的體系能形成透明納米乳。室溫放置后，無水乙醇-水體系變濁，其余種體系仍澄清透明。

分別以1,2-丙二醇、PEG400、山梨醇為助表面活性劑，磷脂為表面活性劑，大豆油為油相，Km=1∶1，繪制偽三元相圖，進一步比較各體系形成納米乳區(qū)域面積。實驗結(jié)果表明，含山梨醇體系的納米乳區(qū)域面積最大。納米乳區(qū)域的大小和納米乳的穩(wěn)定性有很大的關(guān)系，納米乳區(qū)域面積大說明該體系形成的納米乳最穩(wěn)定，山梨醇的助乳化能力最強，故選取山梨醇為助表面活性劑，大豆油為油相。

經(jīng)過以上一系列試驗的篩選，空白納米乳的處方可以確定為：表面活性劑——磷脂，助表面活性劑——山梨醇，油相——大豆油。

空白納米乳偽三元相圖的繪制以大豆油為油相，磷脂為表面活性劑，山梨醇為助表面活性劑，參照文獻［4］繪制偽三元相圖，確定納米乳區(qū)的范圍，找出各組分的最佳比例。

將磷脂和山梨醇按質(zhì)量比Km=1∶1，1∶2，2∶1混勻后，再按磷脂與油酸乙醋的質(zhì)量比為1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5的不同比例混合。先讓其磁力攪拌均勻，再邊攪拌邊用水滴定，以澄清度為指標，判斷是否形成納米乳，記錄形成納米乳時臨界點各組分的質(zhì)量百分含量。在相圖中找出相應(yīng)的點，把能形成納米乳的各點以曲線相連繪制成偽三元相圖。結(jié)果見圖1～3。

圖中每一條邊表示相應(yīng)兩組分的比例關(guān)系，任一點表示各組分的質(zhì)量百分含量。在滴定過程中，開始會出現(xiàn)粘度較大的狀態(tài)，甚至形成凝膠攪拌困難，但當水滴加到某一點時，體系的粘度突然變小似水，流動性極好形成澄清、透明的納米乳，此時可以作為形成納米乳的臨界點。本實驗繪制的三元相圖中只標出了納米乳區(qū)，納米乳區(qū)的大小和納米乳的穩(wěn)定性有很大關(guān)系，納米乳區(qū)越大說明納米乳越穩(wěn)定，越不易受其它因素的干擾。

由空白納米乳三元相圖可知當Km=1∶1時，納米乳的區(qū)域最大，即最穩(wěn)定。所以選用Km=1∶1作為處方中表面活性劑與助表面活性劑的重量比，選取該比例進行空白納米乳的制備。從Km=1∶1的三元相圖上進行處方的優(yōu)化，以選擇各成分的用量比例關(guān)系。從圖上可以看出納米乳的最大載油量約為﹪，混合表面活性劑的用量約為75﹪。越接近納米乳區(qū)域邊緣體系越不穩(wěn)定，綜合考慮納米乳的穩(wěn)定性及表面活性劑的用量用量過大可能會對人體胃腸粘膜造成一定的傷害，用量過少對油的乳化能力弱，以至于不能形成穩(wěn)定的納米乳，取油相和混合表面活性劑最大用量的50﹪來制備納米乳，即油相用量占﹪，混合表面活性劑的用量占40﹪，也就是磷脂∶山梨醇∶大豆油∶水的重量比20∶20∶∶此時形成的納米乳體系較穩(wěn)定，表面活性劑的用量適中，納米乳的流動性極好。

葛根素含量測定標準曲線的繪制和回歸方程的建立

吸收波長的選擇精密稱取葛根素適量，用超純水溶解并稀釋至適當濃度，于200～600nm波長進行掃描，并以空白納米乳為對照。結(jié)果表明，葛根素在和250nm和305nm處有兩個吸收峰，空白納米乳在250nm處吸收較強，對測定結(jié)果干擾較大，在波長305nm處幾乎無吸收，不干擾測定。故選擇305nm為測定波長。

葛根素標準曲線的繪制及回歸方程的建立精密稱取葛根素0g，用超純水溶解并稀釋定容至500ml，制得200μg·ml-1的葛根素儲備液。取適量該儲備液，配置一系列適當濃度的葛根素溶液，在305nm處對不同濃度的葛根素溶液進行吸光度的測定。結(jié)果如圖4所示，表明葛根素在0～30μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

葛根素納米乳類型鑒別采用離心法［5］、染色法［6］鑒別納米乳。離心法是以6000r·min-1離心30min，觀察是否分層，顏色、澄清度是否改變，若經(jīng)過離心不分層，顏色、澄清度都無變化可判斷為納米乳。取葛根素納米乳成品進行上述實驗，證實制備的樣品為納米乳。

判斷葛根素納米乳的類型：利用油溶性染料蘇丹紅和水溶性染料亞甲蘭在納米乳中擴散的快慢來判斷納米乳的類型，若紅色擴散快于藍色則為W/O型納米乳,反之則為O/W型納米乳。結(jié)果表明，本實驗所制得的葛根素納米乳為O/W型納米乳。

飽和葛根素納米乳液的制備將過量的葛根素加入到由磷脂、山梨醇、大豆油按處方比例組成的混合液中，渦旋混勻，加入處方量的水，磁力攪拌混勻，于37℃攪拌24h，然后再以6000r·min-1離心40min，取上清液，即得到葛根素納米乳飽和液體。

將上述飽和液用超純水稀釋成適當濃度，于305nm處測吸收度并計算濃度。按上述方法實際測得飽和葛根素納米乳液的含量分別為取平均值為mg·ml-1，即葛根素在納米乳中的溶解度為mg·ml-1。

據(jù)文獻［7］報道葛根素在水中的溶解度約為mol·L-1，顯然低于本實驗制得的納米乳中葛根素的含量。

葛根素納米乳質(zhì)量評價

外觀性狀制得的葛根素納米乳液為澄清、透明的淺黃色、流動性極好的液體。

理化性質(zhì)電導(dǎo)率可以用來判斷納米乳的類型，電導(dǎo)率較大的為O/W型納米乳，電導(dǎo)率較小的為W/O型納米乳；粘度和折光率可以用來檢查納米乳的純度；納米乳的流變性對納米乳的制備和使用具有重要意義，注射劑必須通針性好，對機體刺激性小，不引起疼痛，故要求體系粘度較低。研究表明，葛根素納米乳中油量增加，則納米乳的粘度增加，但均能自由流動，并具有良好的通針性。

取注射用葛根素納米乳樣品適量，用數(shù)字式粘度計測定粘度，用電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率，用阿貝折光儀測定折光率。測定結(jié)果見表1。表1葛根素納米乳的理化性質(zhì)

形態(tài)和粒徑分布采用透射電鏡研究納米乳形態(tài)。取適量葛根素納米乳滴在銅網(wǎng)上，用磷鎢酸溶液負染后晾干，于透射電鏡下觀察。結(jié)果見5。從圖5可以看出，葛根素納米乳乳滴呈球形，大小均勻。

納米乳粒徑和粒徑分布采用激光散射粒度測徑儀測定。結(jié)果表明，葛根素納米乳平均粒徑為，％的乳滴粒徑在～nm之間，說明制備的注射用葛根素納米乳粒徑分布較窄，粒徑較均勻。

穩(wěn)定性

離心穩(wěn)定性：將制備的葛根素納米乳以6000r·min-1離心40min，觀察有無分層、沉淀或渾濁等現(xiàn)象。結(jié)果表明葛根素納米乳未出現(xiàn)分層、沉淀或渾濁等異?，F(xiàn)象。

配伍穩(wěn)定性：用葡萄糖注射液或氯化鈉注射液將葛根素納米乳稀釋50倍，納米乳外觀仍澄清透明。長期穩(wěn)定性：將本實驗制得的葛根素納注乳灌封于安瓿瓶中，分別置于4，25，37，60℃的條件下進行穩(wěn)定性考察，于0，10，30，60，90，180d分別取樣進行性狀觀察、粒徑測定和含量分析。結(jié)果表明，葛根素納米乳在上述條件下，色澤、透明度、粒徑和含量未有顯著變化，說明葛根素納米乳受溫度影響較小，性質(zhì)比較穩(wěn)定。

3討論

通過篩選合適的注射用油、乳化劑和助乳化劑，并通過偽三元相圖尋找最佳的納米乳處方和工藝，成功地制備了葛根素注射用納米乳，證實了納米乳能夠顯著增加在水和油中均難溶的藥物葛根素的溶解度，葛根素在納米乳中的溶解度是其在水中溶解度的6倍。國外報道的油、水均難溶的喜樹堿在納米乳中的溶解度是水溶液的23倍［8］。溶解度增大，有助于提高難溶性藥物的生物利用度。

納米乳制備過程中往往須加入較高濃度的表面活性劑，以降低液滴表面張力，得到粒徑較小的乳滴。大量表面活性劑可能對機體產(chǎn)生不良反應(yīng)［9］。本研究選用的表面活性劑為注射用豆磷脂，其毒性、刺激性和溶血性均較小，適合作為注射用乳劑的乳化劑。通過處方和工藝優(yōu)化，有效地降低了乳化劑的用量。

本實驗對制備的葛根素納米乳的質(zhì)量進行了較為詳盡的評價，除了測定葛根素的含量外，還對納米乳的粘度、電導(dǎo)率、折光率、粒徑和粒徑分布等理化性質(zhì)作了測定，對穩(wěn)定性亦作了考察。注射用葛根素納米乳能否有效地降低或消除常規(guī)葛根素注射液時的不良反應(yīng)，提高葛根素的療效，尚需作進一步深入研究。

【參考文獻】

［1］丁國華.葛根素注射液的不良反應(yīng)［J］.時珍國醫(yī)國藥，2001，12：476.

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［3］胡靜，徐德生.葛根素藥理和臨床研究進展［J］.世界臨床藥學(xué)，2006，27：215.

［4］汪揚，吳偉.油-