微生物實驗 實驗一 微生物培養(yǎng)基的制備方法

------------------------------------------------------------------------微生物實驗實驗一微生物培養(yǎng)基的制備方法實驗一微生物培養(yǎng)基的制備方法培養(yǎng)基(medium)培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。任何培養(yǎng)基中均需含有微生物所必需的能源、碳源、氮源、礦質(zhì)元素、水和生長因素，但不同營養(yǎng)類型、不同種類的微生物對營養(yǎng)元素的要求又有很大差異。目前已使用的各種培養(yǎng)基都是前人經(jīng)過反復實踐，比較設計的成果。

二、培養(yǎng)基的基本成分

●能源、碳源：自養(yǎng)微生物以二氧化碳為碳源，光或無機物為能源，在無機物組成的培養(yǎng)基中生長。例如化能自養(yǎng)型的氧化硫桿菌培養(yǎng)基中，加入粉末狀硫為能源，以空氣中的CO2為碳源。異養(yǎng)微生物以有機物為碳源和能源，培養(yǎng)基中常需加入葡萄糖、蔗糖或麥芽糖、乳糖等單糖或雙糖，有的可利用淀粉、纖維素等多糖，或利用動物組織中的糖類。例如培養(yǎng)細菌常用的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其中牛肉膏即為主要碳源和能源?！竦矗鹤责B(yǎng)微生物以含氮無機物銨鹽、硝酸鹽等為氮素營養(yǎng)，例如氧化硫桿菌以(NH4)2SO4為氮源；異養(yǎng)微生物以無機物銨鹽、硝酸鹽或含氮有機物為氮源。自生固氮菌利用空氣中的N2為氮素營養(yǎng)，其培養(yǎng)基中無須加入氮源，稱為無氮培養(yǎng)基。

●礦質(zhì)元素、生長因子：微生物生長繁殖需要P、K、Na、S、Mg、Ca等主要礦質(zhì)元素以及Fe、Cu等微量元素，因此培養(yǎng)基中常加入K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、KCl、FeSO4等無機鹽類；生長因子主要是調(diào)節(jié)微生物代謝活動的B族維生素，常由酵母膏、肝浸出液等提供。許多天然成分的原料如牛肉膏、麥芽汁、玉米粉、豆芽汁等，含有各種無機元素和生長因子，不需另外添加。

三、培養(yǎng)基的類型根據(jù)原料來源不同，可將培養(yǎng)基分為合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基與天然培養(yǎng)基。

●合成培養(yǎng)基：由化學成分已知的有機物和無機物配制而成。成分精確，重復性強。但營養(yǎng)局限，微生物生長緩慢。適用于菌種分離、選育、遺傳分析及生物測定等。如培養(yǎng)放線菌的高氏培養(yǎng)基、培養(yǎng)霉菌的察氏培養(yǎng)基以及各種化能自養(yǎng)菌培養(yǎng)基等。

●半合成培養(yǎng)基：由某些天然物質(zhì)與少量已知成分的化學物質(zhì)配制而成。營養(yǎng)全面，能有效地滿足微生物對營養(yǎng)的需求。廣泛應用于微生物的培養(yǎng)。如培養(yǎng)細菌用的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)霉菌的土豆葡萄糖培養(yǎng)基，工業(yè)生產(chǎn)中常用的玉米粉等天然物質(zhì)加無機鹽配制的各種發(fā)酵培養(yǎng)基等。

●天然培養(yǎng)基：由化學成分不清楚或不衡定的天然有機物配制而成。成分復雜，但營養(yǎng)豐富全面。常用于實驗研究和生產(chǎn)。如麥芽汁培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基，以及生產(chǎn)中使用的麩皮、鋸末等。

四、培養(yǎng)基的形態(tài)

根據(jù)培養(yǎng)基的物理性質(zhì)，可分為液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。

●液體培養(yǎng)基：用各種營養(yǎng)成分加水配成，或用天然物質(zhì)的浸汁(麥芽汁、豆芽汁等)制成。組分均一，適宜各類微生物的營養(yǎng)生長。主要用于增菌培養(yǎng)，觀察細菌不同的生長現(xiàn)象以及檢測細菌的生化特性以供鑒別之用。

●固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑，或用麩皮等固體原料配制。常用的凝固劑是瓊脂(又稱瓊膠、洋菜)，由石花菜等海藻中提取加工制成。市售瓊脂為條狀、片狀或粉末狀，主要成分為多聚半乳糖的硫酸酯，絕大多數(shù)微生物不能將其分解，在培養(yǎng)基中僅起支撐作用。其熔點約98℃，凝固點42℃，1.5～2％的水溶液在一般培養(yǎng)溫度下呈凝膠狀態(tài)。瓊脂固體培養(yǎng)基廣泛應用于微生物的分離培養(yǎng)、菌種鑒定和保藏。

●半固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入0.2～0.5％瓊脂制成。用于觀察細菌的運動、菌種鑒定及測定噬菌體的效價等。

五、培養(yǎng)基的種類根據(jù)培養(yǎng)基的用途，可分為選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基等。

●選擇培養(yǎng)基：根據(jù)某一類或某種微生物的特殊營養(yǎng)要求而設計的培養(yǎng)基，用于提高所需微生物的分離效率。如分離固氮微生物的無氮培養(yǎng)基、加入濾紙條或纖維素粉為碳源分離纖維分解菌的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入某種化合物，可有效地分離出對這種化合物有抗性的微生物，例如在放線菌培養(yǎng)基中加入數(shù)滴10％的酚，可抑制細菌和霉菌的生長；加入一定量的青霉素、鏈霉素，可抑制細菌生長等。

●鑒別培養(yǎng)基：根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑，通過顯色反應以鑒別不同的微生物。例如檢查乳制品和飲用水中是否有腸道細菌污染所用的伊紅-美藍培養(yǎng)基。當大腸桿菌等腸道細菌生長時，發(fā)酵培養(yǎng)基中的乳糖，使加入的伊紅-美藍變色，在菌落上沉積為紫黑色，并呈現(xiàn)金屬光澤。

●加富培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)，促使某種特殊性能的微生物迅速生長，有利從混合菌群中分離出所需種類微生物。如為分離能夠利用石蠟的微生物，常在培養(yǎng)基中加入石蠟作為碳源。

六、培養(yǎng)基的制備方法（常規(guī)方法，如配方中有特殊規(guī)定或要求，以配方為依據(jù)）根據(jù)配方，計算各種營養(yǎng)成分用量。一般藥品可用普通藥物天平稱量，用量少的藥品，可按比例配成高濃度溶液，再按所需量用移液管吸取。稱好的藥品放入玻璃燒杯中。

2.在另一容器中將所需量的水(一般可用自來水，有特殊要求時需用蒸餾水)加熱，取全量的1/3左右倒入放藥品的容器中，用玻璃棒攪拌，待藥品全溶后，再將其余熱水全部倒入。若配制固體培養(yǎng)基，則稱取1.5～2％的瓊脂放入已溶化的營養(yǎng)液中，繼續(xù)加熱至瓊脂全部溶解。加熱中隨時攪拌，防止溢出或糊底。燒糊的培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)破壞，并產(chǎn)生有毒物質(zhì)，不宜再用。

4.待溶化的培養(yǎng)基稍冷卻后，按配方要求調(diào)整pH值。先取10毫升培養(yǎng)基裝入試管中，用pH試紙測其自然pH，再用1％NaOH(或1％HCl)調(diào)至所需pH，根據(jù)用量計算，換用10％NaOH(或10％HCl)調(diào)整所配全量培養(yǎng)基的pH。加堿(或酸)溶液時，應邊滴加邊攪拌，至應加量將近用完時，再次測試，最后調(diào)至要求的pH值。

5.配好的培養(yǎng)基，根據(jù)需要趁熱分裝至試管或錐形瓶中。分裝需用漏斗，以免瓊脂粘在管口或瓶口上。裝瓶量一般為瓶容量的1/3～1/2；裝試管一般為試管高度的1/5～1/4，以免滅菌時培養(yǎng)基上溢，粘濕棉塞。

6.用預先制好的棉塞塞住管口或瓶口。棉塞既有利于通氣，又有濾菌作用，故松緊、大小應適當，以免使用時影響操作。

最后用牛皮紙或報紙包住棉塞，扎緊在瓶頸或試管上方，以免滅菌時水蒸汽沾濕棉塞或脫落。

7.滅菌后取出的固體培養(yǎng)基，根據(jù)需要可將試管立即斜放，冷凝后即成斜面培養(yǎng)基，用于菌種擴大培養(yǎng)及保藏；錐形瓶中的培養(yǎng)基，倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷凝后即制成平板培養(yǎng)基，可用于菌種的分離、鑒定等。液體培養(yǎng)基冷卻后可直接根據(jù)需要接入菌種。七、高壓蒸汽滅菌這種滅菌方法是基于水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設計的。當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15～30min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標本和工作服等都可應用此法滅菌。操作方法和注意事項打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線。立式消毒鍋最好用已煮開過的水，以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存。注意水要加夠，防止滅菌過程中干鍋。2、滅菌材料放入器皿內(nèi)，注意間隔，不能擺的太緊。材料放好后，關(guān)閉滅菌器蓋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。3、根據(jù)滅菌材料的要求，設置相應的壓力和滅菌時間。注意事項：使用高壓蒸氣滅菌器時，首先應注意在開放蒸氣的同時，排除滅菌器內(nèi)的冷空氣。必須將器內(nèi)冷空氣全部排除后，才可關(guān)閉排氣孔。假如滅菌器內(nèi)仍存留有部分空氣時，剛壓力表上雖已達到了某一壓力值，但器內(nèi)之溫度仍未達到相應之度數(shù)。存留的空氣越多，剛二者相差也越大。差也越大，器內(nèi)溫度不足，滅菌則不徹底。表蒸汽壓力與溫度的關(guān)系蒸汽壓力（kPa）密度（kg/cm2）溫度（℃）34.480.35210955.160.56311368.950.703115103.431.055121137.901.406126

表高壓蒸汽滅菌器中溫度與冷空氣排出量的關(guān)系

蒸汽壓力（kPa）所達溫度（℃）冷空氣完全排除2/3排除1/2排除1/3排除全未排除34.4810910