第五章分子生物學方法重組DNA技術

第五章分子生物學研究方法簡介

第一節(jié)重組DNA技術

一、重組DNA技術相關概念

（一）DNA克隆

克隆（clone）： 來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。

克隆化（cloning）： 獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。 分子克?。―NA克?。? 細胞克隆 個體克隆（動物或植物）

DNA克?。簯妹笇W的方法，在體外將各種來源的DNA與載體DNA結合成具有自我復制能力的DNA分子，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行 擴增、提取獲得大量同一DNA分子。又稱基 因克隆或重組DNA。

基因工程：

實現基因克隆所采用的方法及相關 的工作，又稱為重組DNA技術(recom-binantDNAtechnology)。

（二）工具酶 限制性核酸內切酶 DNA聚合酶I 逆轉錄酶 DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉移酶

TaqDNA聚合酶

限制性核酸內切酶（restrictionendonuclease）

識別DNA的特異序列，并在識別位 點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。 是細菌內存在的保護性酶。分為I、II、III三類。II類酶識別序列特點為回 文結構。

······GGATCC······ ······CCTAGG······

限制性核酸內切酶作用后產生兩種末端：

鈍性末端(bluntend)粘性末端(stickyend)

5′-端突出

粘性末端

3′-端突出

限制性核酸內切酶識別序列長度為4~8個bp。 不同酶切產生的相同粘性末端稱配伍末端（compatibleend），可用連接酶連接。

（三）目的基因應用重組DNA技術所要分離、獲得的基因。 1.cDNA(complementaryDNA):是指經反轉錄合成的，與RNA互補的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板，經聚合反應可合成雙鏈cDNA。 2.基因組DNA（genomicDNA）：是指代表一個細胞或生物體整套遺傳信息（染色體 及線粒體）的所有DNA序列。

（四）基因載體（vector）能攜帶目的基因，實現無性繁殖所采用的 可獨立復制的完整DNA分子。又稱克隆載體。其中為表達出蛋白質設計的載體又稱表達載 體。

常用的載體： 質粒、噬菌體DNA、病毒DNA

載體的選擇標準：

能自主復制；

具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；

有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；

分子量小，以容納較大的外源DNA。

1.質粒（plasmid）

是存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA 分子。大小約為 數 千堿基對。常 有 1~3個抗藥 性 基因，以利于 篩 選。

2.噬菌鈴體（ph撥ag兆e）DN淘Aλ噬菌桑體DN猛A改造蒸系統(tǒng)λgt系列肝（插語入型袍，適囑用cD羽NA克隆嫂）EM鵲BL系列豬（置幟換型磚，適占用基暮因組繭克隆藥）M1券3噬菌考體DN乳A改造病系統(tǒng)（含la睬cZ基因企）M1紅3m負p系列pU冶C系列3.其他柯斯易質粒傷（co詞sm掘id）酵母那人工荒染色揮體載敢體（ye邊as鏟t利ar輔ti羅fi賺ci劈燕al請c穿hr才om政os癢om竿e,蛙YA斧C）細菌描人工虧染色蜘體（ba厚ct益er親ia亮l幻玉ar害ti向fi含ci眨al兆c用hr磚om寸os糕om嘩e,線BA蓬C）動物抵病毒DN勾A改造宿的載芽體（如凍腺病辣毒、燈腺病姥毒相準關病貿毒、這逆轉幅錄病毒鼓）二、虜重組DN鋸A技術爛基本睡原理1、目計的基瀉因的咬獲取2、基癥因載拍體的宋選擇琴與構顆建3、目涌的基外因與競載體由的拼歇接4、重轉組DN廢A分子倘導入轎受體沉細胞5、篩康選并粥無性讀繁殖嚇含重溝組分士子的受衫體分惡子（珍轉化論子）（一）目的縫基因混的獲社取1.化學己合成評法用于肅已知床序列閱，或侍可推伴導出記序列廚的基糖因2.基因夠組DN供A基因脫組DN根A文庫瘦（ge呈no龍mi犁c泥DN美A淘li虧br鑼ar耕y）3.cD岡NAcD翠NA文庫丹（cD鄰NAli戰(zhàn)br牙ar薯y）4.聚合植酶鏈趴反應專（po換ly圓me俊ra鉗se貨c縫ha花in求r志ea益ct額io嫁n,劑PC循R）基因蕩組DN邊A文庫存在稠于轉寒化細證菌內驅，由克釋隆載明體所芽攜帶柿的所有基嶺因組DN偶A的集惑合。簡稱G－文庫。cD魄NA文庫用細嬌胞總mR倒NA制備麻全套脫雙鏈cD扭NA后，建立剛的基等因文革庫。刺簡稱c－文庫冷。PC嗚R是根集據DN醬A復制蔽的原玩理，綢在體抽外利笛用酶促津反應駝獲得浩特異氧序列尚的基共因組DN跟A或cD輕NA的專眾門技板術。PC饅R的反盒應體拘系：石模板DN沖A、特異奔性引峰物、DN貨A聚合故酶、dN巨TP及含扒有Mg2＋的緩同沖液屯。PC跡R的基賭本反績應步淡驟：1.變性：將姐反應卷系統(tǒng)圈加熱貼至95兄℃，使模板DN鳳A完全鞏變性陳成為揮單鏈遇；2.退火：將窗溫度毅下降需至50成℃左右在，使邀引物與潔模板DN西A退火峰結合脊；3.延伸：將評溫度買升至72研℃，DN愉A聚合渴酶以dN哈TP為底蘋物催飯化DN羽A的合掃成反顧應。上述載三個片步驟虧為一襪個循例環(huán)，尖經25～30次循環(huán)后呀，可甩將模麻板DN昆A擴增停達百扎萬倍亭。（二）克隆剝載體毅的選籍擇（三）外源您基因撥與載秩體的造連接1.粘性條末端劫連接2.平端捷連接限制散性內蔑切酶器作用煉產生顯的平研端粘端詳經特澡殊酶滋處理炸變?yōu)楣钠蕉?.同聚燃物加持尾連昂接由末辯端轉袋移酶蚊作用掛，在DN骨A片段麗末端客加上同犬聚物稿序列態(tài)，制電造出冷粘性葬末端蘋再連政接。4.人工陪接頭由平斬端加由上帶煮有新者的酶播切位月點的障寡核拾苷酸，尊再用迷限制綠酶切兆產生漂粘性堂末端駱，進箏行連翻接。（四既）重委組DN販A導入衣受體緒菌受體寧菌條踏件：安全渣宿主伏菌限制兔酶和犁重組捐酶缺柄陷處于螞感受模態(tài)導入匪方式桌：轉化轉染蘿（tr是an逝sf蛙ac后ti比on）感染尖（in半fe求ct景io予n）（五斤）重拳組體鵝的篩煉選重組DN欺A導入梁受體它菌后吐，經皂過培養(yǎng)使棄其大您量繁數殖，滾再設璃法將酸含有茄目的基因磨的菌水落區(qū)好分鑒沫定出動來，兔這一欣過程即為瞧篩選病（sc勢re影en榨in碑g）或選錦擇（se扯le款ct萌io姥n）。1.直接忍選擇速法：針對脆載體酷攜帶滅某種棄或某湊些標留志基曬因和目撞的基頑因而性設計競的篩肌選方蘆法。運其特點是辮直接匆測定憐基因誤或基鈔因表慚型?？顾帍匦詷司佑涍x清擇（諷插入躺失活皆法）怪：將目倉的基詢因插什入帶am薄pr和te瘡tr基因的載體的te離tr基因訂中，元則te嗎t(yī)r基因島失活存。在耗分別含有撞氨芐治青霉削素和展含四盆環(huán)素賺的兩甚個培香養(yǎng)基冬中培養(yǎng)背，進翅行篩貸選。標志摘補救忽（ma裙rk商er榆r調es麗cu猾e）若目獻的基腎因能王夠在細宿主加菌表獄達，痰且表穿達產物移與宿殃主菌米的營齊養(yǎng)缺閉陷互碎補，呈就可館利用馳對營養(yǎng)嶺素的胡依賴狼表型卷來篩間選。分子非雜交怎法：利用32P標記偶的探誘針與備轉移漠至硝潤酸纖塌維素膜上春的轉艱化子DN殲A或克策隆的DN悔A片段盯進行擾分子雜交區(qū)，直扁接選脈擇并健鑒定芹目的肆基因猾。原位花雜交So窩ut熄he坊rn印跡2.非直脂接選容擇法妖：免疫盟學方蓬法：唉利用蹄特異季抗體許與目累的基因材表達逮產物堵相互松作用貞進行視篩選線。包況括：免疫神化學稅方法酶免檢測專法（六濃）克源隆基帶因的險表達表達輔體系訴的建德立：表達毫載體濁的構價建受體滑細胞唉的建貼立表達掩產物沿的分捏離、杏純化1.原核朗表達越體系E.我co倦li的標蔬準：選擇皇標志強啟駕動子翻譯鐵調控學序列多接夸頭克螞隆位雹點E.輕co舅li的不安足：缺乏疼轉錄旁后加縱工機面制缺乏懼翻譯境后加目工機求制表達省產物舒形成挨不溶月性包匯涵體很難陽表達斜大量磁可溶蹈性蛋礙白2.真核縱表達塊體系如酵慈母、喇昆蟲誤及哺崗乳類崗動物牽細胞優(yōu)點道：可表獎達克厲隆的cD銹NA及真顫核基溫因組DN貸A可適耐當修潮飾表乒達的本蛋白菌質表達還產物遍分區(qū)耐積累缺點臉：操作握技術化難、幅費時味、不蹈經濟轉染請：將表訓達載摧體導柄入真槐核細橡胞的奧過程三、陪重組DN夫