樣品的前處理方法

樣品的前處理方法目前一頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點一、概述：1、樣品處理的目的氣相色譜

高效液相色譜色譜分析技術(shù)高效毛細(xì)管電泳

平面色譜氣相色譜—質(zhì)譜

聯(lián)用技術(shù)液相色譜—質(zhì)譜液相色譜—核磁氣相色譜—紅外目前二頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點

石化過程分析工業(yè)衛(wèi)生調(diào)查和評價藥物動力學(xué)和毒理學(xué)研究食品分析法庭取證分析色譜法應(yīng)用醫(yī)療診斷核能和燃料分析制藥過程監(jiān)測化妝品和香料組成分析商品質(zhì)量檢驗?zāi)壳叭揬總數(shù)六十四頁\編于二十二點樣品預(yù)處理的目的除去微粒減少干擾雜質(zhì)濃縮微量的組份提高檢測的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于色譜柱及儀器的保護(hù)目前四頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點2、樣品處理的必要性和重要性色譜分析的全過程包括：樣品采集、樣品制備、色譜分析、數(shù)據(jù)處理與結(jié)果表述

樣品種類繁多，其組成、濃度、物理形態(tài)等均是色譜分析測定的影響因素。樣品處理技術(shù)就成為提高分析測定效率、改善和優(yōu)化色譜分析的重要環(huán)節(jié)目前五頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點占樣品分析時間的比例（>60%）樣品預(yù)處理所用時間遠(yuǎn)大于色譜分離的時間占分析的消耗總成本最大消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品實驗的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié)影響實驗結(jié)果好壞的最重要因素

是決定性的步驟目前六頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點3、樣品處理的原則（1）樣品中可能存在的物質(zhì)組成？濃度水平？（2）樣品中的主要組分？（3）采樣方法是非破壞性的還是破壞性的？（4）收集的樣品必須有代表性。（5）采用方法必須和分析目的保持一致。目前七頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點3、樣品處理的原則（續(xù)）（6）樣品制備過程中盡可能防止和避免待測定組分發(fā)生化學(xué)變化或丟失（7）樣品處理中，若進(jìn)行待測定組分的化學(xué)反應(yīng)，則反應(yīng)應(yīng)是已知的和定量完成的。（8）樣品制備過程中，要防止和避免待測定組分受到污染，減少無關(guān)化合物引入制備過程。目前八頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點3、樣品處理的原則（續(xù)）（9）處理過程應(yīng)簡單易行，所用樣品處理裝置的尺寸應(yīng)與處理樣品的量相適應(yīng)。（10）采樣后應(yīng)盡可能快的進(jìn)行分析樣品的制備和分析，或使用適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ赡墚a(chǎn)生的干擾，做好樣品的保存。目前九頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點二、樣品的采集

氣體（包括蒸汽）涉及的樣品形式液體（包括乳液）固體（包括氣體懸浮物、液體懸浮物）直接采集主要采集方法富集采集化學(xué)反應(yīng)法采集目前十頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點直接采集：只需將樣品直接引進(jìn)容器中，所用容器最好是新的或洗凈后干燥的，以防止其他樣品的殘留影響。富集采集：是在采集過程中，同時將待測組分富集，如吸附采樣中選擇合適的吸附材料，在吸附的同時使待測材料在吸附材料上富集目前十一頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點使用采集方法的注意事項（1）采集的樣品應(yīng)具有代表性，要注意采樣的時間、地點及采樣位置的選擇。（2）所有樣品都要采集雙份，一份分析樣品，一份保存樣品，備復(fù)查時使用。（3）樣品的采集和儲存過程要作記錄，詳列采樣時間、地點、準(zhǔn)確位置等。目前十二頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點（4）采集儲存中待測組分不應(yīng)有損失或發(fā)生化學(xué)變化。

損失—包括揮發(fā)、在儲存容器上的吸附等物理原因

化學(xué)變化——包括被氧化、微生物引起的分解、各組分間的化學(xué)反應(yīng)等（5）避免樣品受到外界污染。（6）采集后要盡快進(jìn)行分析樣品的制備和分析。目前十三頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點三、樣品預(yù)處理常用的方法高速離心過濾、超濾選擇性沉淀萃取索氏抽提衍生反應(yīng)加速溶劑萃取（ASE）濃縮樣品液-固萃取/液-液萃取固相萃取樣品小柱目前十四頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點樣品預(yù)處理的過程目前十五頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點去除微粒過濾可重復(fù)使用過濾裝置/過濾膜有機(0.22μm)/無機(0.22μm)膜片可更換一次性使用的膜使用方便簡單，交叉污染小有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理高速離心大于：10,000rpm目前十六頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點超濾機理超濾是一種基于分子量分離的技術(shù)目的根據(jù)分子量的不同把分子、細(xì)胞及病毒等分為不同的餾份除去小分子樣品中的大分子蛋白脫鹽目前十七頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點選擇性沉淀常用于生化樣品中除蛋白有機溶劑：乙腈、甲醇強酸：三氯乙酸、過氯酸鹽：50%硫酸銨目前十八頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點樣品衍生提高檢測的靈敏度增加紫外基團(tuán)以增強紫外檢測的靈敏度增加熒光基團(tuán)使樣品用高靈敏度熒光檢測器改變分離的選擇性改變組份的基團(tuán)，如：變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離典型的例子氨基酸分析目前十九頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點加速溶劑萃取（ASE）ASE是用溶劑對固體、半固體的樣品進(jìn)行萃取的技術(shù)ASE的原理是選擇合適的溶劑、通過增加溫度和壓力來提高萃取過程的效率ASE可用來替代索氏提取、超聲萃取、手工振搖、煮沸法和其他萃取方法目前二十頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點三種不同型號的ASEASE100↑ASE200↓ASE300↑目前二十一頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點ASE的突出優(yōu)點快速，15分鐘溶劑用量少萃取效率高樣品基體影響小可同時選用四種溶劑萃取安全，全自動ASE建立了環(huán)境,藥物,聚合物,食品,和化妝品工業(yè)的大量應(yīng)用目前二十二頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點ASE工作流程加溶劑時間(min) 0.5–1加樣品靜態(tài)萃取5氮氣吹掃 1–2溶劑泵吹掃閥爐體氮氣瓶靜態(tài)閥收集瓶萃取池循環(huán)加熱 5加壓萃取結(jié)束Total(min)準(zhǔn)備分析 12–18新溶劑沖洗 0.5目前二十三頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點食品安全評價中ASE的應(yīng)用水果和蔬菜中的農(nóng)藥動物組織中的二噁英和多氯聯(lián)苯糧食中的農(nóng)藥糧食中的毒枝菌素熏肉中的多環(huán)芳烴葡萄干中的殺真菌劑咸肉中的硝酸鹽/亞硝酸鹽一些正在發(fā)展的方法目前二十四頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點ASE的應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)境農(nóng)業(yè)、食品聚合物制藥目前二十五頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點濃縮樣品濃縮樣品的方法

萃取/吹干

沉淀/再溶解

色譜法

液固抽提/固相萃取小柱

目前二十六頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點固相萃取（SPE）技術(shù)固相萃取技術(shù)是基于同液相色譜同樣技術(shù)開發(fā)的產(chǎn)品，分離復(fù)雜樣品中的不同組份固相萃取技術(shù)（SPE）的重要性實驗室中60~80%的成本及工作量在樣品制備上加速樣品的制備時間降低樣品前處理的成本提高分析的準(zhǔn)確性及回收率更容易自動化減少樣品處理步驟降低對不穩(wěn)定樣品的影響提高安全性目前二十七頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點SPE小柱SPE小柱的應(yīng)用領(lǐng)域除去雜質(zhì)及干擾組份把樣品分成不同極性的組進(jìn)行分析富集微量的組份SPE小柱的主要種類反相正相離子交換目前二十八頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點SPE小柱的種類反相正相離子交換固定相非極性極性帶電荷溶劑從極性到非極性從非極性到極性PH或離子強度（低到高）?根據(jù)SPE小柱的種類及樣品的性質(zhì)，選洗脫強度不同的溶劑把樣品分開?讓樣品的各組份在固定相上吸附、解吸附，或不與固定相作用第一步：讓所感興趣的樣品留在小柱，雜質(zhì)通過小柱第二步：用不同極性的溶劑，使所感興趣的樣品通過小柱目前二十九頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點SPE小柱使用方法

準(zhǔn)備進(jìn)樣萃?。陛腿。材壳叭揬總數(shù)六十四頁\編于二十二點各種SPE小柱（一）正相使用方法可先用6到10倍柱體積的非極性溶劑平衡加入樣品用非極性溶劑洗脫不想要的組份用極性溶劑洗脫第一組感興趣的組份用極性更強的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份在不同條件下，有些填料可以用于反相或離子交換，如∶NH2/CN確認(rèn)回收率目前三十一頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點各種SPE小柱（二）反相使用方法可先用6到10倍柱體積的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍柱體積的水或緩沖液平衡，不要讓小柱干了樣品溶解在強一些極性的溶劑中加入樣品用強極性溶劑洗脫不想要的組份用極性弱些的溶劑洗脫第一組感興趣的組份用極性更弱的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份確認(rèn)回收率目前三十二頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點各種SPE小柱（三）離子交換使用方法可先用6到10倍柱體積的去離子水或弱緩沖液平衡，樣品溶解在去離子水或弱緩沖液中加入樣品用弱緩沖液洗脫不想要的組份用強一些緩沖液（改變pH或離子強度）洗脫第一組感興趣的組份用更強的緩沖液洗脫剩下的感興趣的組份確認(rèn)回收率目前三十三頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點SPE小柱的方法開發(fā)SPE方法開發(fā)的幾個關(guān)鍵因素文獻(xiàn)查閱流速控制同色譜理論：以10ml/min潤濕小柱，1～5ml/min加載樣品離子交換填料或固定相少于100mg的小柱，用更低的流速加載樣品以1～5ml/min流速洗脫樣品注意樣品本底的不同注意載荷量及加樣方式目前三十四頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點四、生物樣品的制備技術(shù)

植物：花、葉、莖、根、果實體液：尿、血液、唾液、胃液、膽汁等生物樣品動物毛發(fā)肌肉組織器官：心、肝、肺、腦、胃、腎、胰腺等微生物

目前三十五頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點生物樣品中需分析的組分：

植物體內(nèi)—營養(yǎng)成分、農(nóng)藥殘留等

動物體內(nèi)—藥物及代謝產(chǎn)物、糖類及有關(guān)化合物、脂類、維生素、核甘、核甘酸及其衍生物、磷酸酯類化合物、固醇類化合物、氨基酸、多肽、蛋白及其衍生物、某些生物大分子目前三十六頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點

生物樣品中待測組分存在的形式及處理方法待測組分存在于體液或細(xì)胞外時：

用萃取的方法提取、濃縮制備樣品用沉淀的方法除去干擾組分（蛋白質(zhì)、DNA、多糖）待測組分存在于生物細(xì)胞內(nèi)：

破碎細(xì)胞，釋放待測組分，再用萃取或沉淀等方法制備樣品目前三十七頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點1.生物樣品的采集采集生物樣品時注意事項：

（1）注意樣品的代表性、典型性和適時性（2）注意采樣部位的準(zhǔn)確，特別是動物的組織器官，一定要認(rèn)準(zhǔn)（3）生物樣品一般都有一定的生物活性，樣品采集后要立即處理（4）生物樣品的采集大部分可以在實驗室內(nèi)進(jìn)行，采樣工具要消毒，最好在無菌的條件下采樣目前三十八頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點2.細(xì)胞的破碎根據(jù)樣品的不同，采用不同的破碎方法：①動物的胰臟、肝臟、腦組織一般比較柔軟，用普通的勻漿器研磨②肌肉及心臟組織較柔韌，要先絞碎再作成勻漿③植物組織用一般碎磨法④含纖維較多組織則必須在搗碎器內(nèi)破碎或加砂研磨⑤對具有堅韌細(xì)胞壁的微生物，常用自溶、冷熱交替、加砂研磨、超聲波和加壓處理等方法。目前三十九頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點細(xì)胞破碎方法的分類目前四十頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點3.生物大分子的提取提取生物大分子樣品時條件的選擇：（1）溶劑常用的溶劑有水、稀酸、稀堿、稀鹽等，也可以采用不同比例的有機溶劑，如：乙醇、丙酮、氯仿、四氯化碳選擇溶劑時要注意物質(zhì)的溶解性，如極性物質(zhì)易溶于極性溶劑；堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑；溫度升高時一般溶解度相應(yīng)增大；遠(yuǎn)離等電點時溶解度增大目前四十一頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點（2）pH值

在穩(wěn)定的范圍內(nèi)，pH選擇在偏離pI的兩側(cè)注意測量pH值的準(zhǔn)確性，誤差不應(yīng)超過0.1（3）溫度一般提取溫度在5℃以下除此之外，還應(yīng)考慮溶劑的離子強度、介電常數(shù)等對提取效果的影響目前四十二頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點4.蛋白質(zhì)的去除（1）加熱法

前提條件：待測組分熱穩(wěn)定性好，而其它易產(chǎn)生熱變性該法最簡單，但只能除去熱變性蛋白目前四十三頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點4.蛋白質(zhì)的去除（續(xù)）（2）鹽析法原理：利用不同蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度有不同程度的降低來沉淀去除蛋白質(zhì)常用的中性鹽有：硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉影響鹽析的條件鹽的飽和濃度

pH的選擇蛋白質(zhì)的濃度溫度的影響

目前四十四頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點4.蛋白質(zhì)的去除（續(xù)）（3）有機溶劑沉淀法蛋白質(zhì)的沉淀和溶解與溶劑的介電常數(shù)有關(guān)常用的有機溶劑：乙醇、丙酮（4）等電點沉淀法原理：利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低，用酸、堿調(diào)pH值，使蛋白沉淀出來缺點：蛋白沉淀不完全目前四十五頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點4.蛋白質(zhì)的去除（續(xù)）（5）膜分離法膜分離技術(shù)：超濾、反滲透析、電滲析、微孔過慮、氣體滲析、超精密過慮等超濾法的特點（與沉淀法比較）適用于小量樣品適用于對酸堿不穩(wěn)定的樣品待測物質(zhì)結(jié)合在膜上，影響回收率超濾膜的材料：醋酸纖維素、聚酰胺、聚砜等目前四十六頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點

4.蛋白質(zhì)的去除（續(xù)）

（6）凝膠層析原理：利用分子大小不同的物質(zhì)在流過凝膠固定相時的保留時間不同，分離待測的小分子化合物和大分子蛋白質(zhì)。（7）柱層析原理：用能吸附蛋白質(zhì)的材料裝填成小柱。使含蛋白質(zhì)的樣品流過，樣品中的蛋白質(zhì)被柱填料吸附，而待測組分則流出小柱。目前四十七頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點4.蛋白質(zhì)的去除（續(xù)）（8）高速離心原理：根據(jù)物質(zhì)沉降系數(shù)、質(zhì)量、浮力因子等的不同，應(yīng)用強大的離心力使物質(zhì)分離、濃縮、提純的方法。目前四十八頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點5.微透析技術(shù)微透析技術(shù)：實質(zhì)上是一種膜分離技術(shù)，它利用膜透析原理，微量地對細(xì)胞液進(jìn)行流動性連續(xù)采樣的新型采樣和色譜樣品制備技術(shù)。目前四十九頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點應(yīng)用一：三聚氰胺測定—樣品預(yù)處理固相萃取柱：陽離子交換固相萃取柱：混合型陽離子交換固相萃取柱，基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60mg，3ml,或相當(dāng)者。處理方法：

使用前依次用3ml甲醇、5ml水活化。目前五十頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點樣品：液態(tài)奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等處理方法：稱取2g試樣于50ml具塞塑料離心管中，加入15ml三氯乙酸溶液和5ml乙腈，超聲提取10min，再振蕩提取10min后，以不低于4000r/min離心10min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25ml，一移取5ml濾液，加入5ml水混勻后做待凈化液。若樣品中脂肪含量較高，可以用三氯乙酸溶液飽和的正己烷液-液分配除酯后再用SPE柱凈化。目前五十一頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點凈化：將待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中。依次用3ml水和3ml甲醇洗滌，抽至近干后，用6ml氨化甲醇（5%）洗脫。整個固相萃取過程流速不得超過1ml/min。洗脫液于50℃下用氮氣吹干，殘留物（相當(dāng)于0.4g樣品）用1ml流動相定容，渦旋混合1min，過微孔濾膜后，供HPLC測定。目前五十二頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點

應(yīng)用二：血清和尿中厚樸酚與和厚樸酚的提取

厚樸酚、和厚樸酚是木蘭科植物厚樸干皮、根皮、枝皮的主要成分，作用是抗菌、抑制胃潰瘍和防止應(yīng)激性胃功能障礙、抑制血小板聚集、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)和降血壓等作用。目前五十三頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點0.5ml血清或1ml尿↓分別加入0.5ml甲醇，離心取上清液0.5ml

加入0.1mol/l的冰醋酸0.1ml

搖勻用乙酸乙酯和乙醚混合液（v/v為1:1）

2ml萃取離心后，取1ml有機相置尖底試管在45℃水浴中用氮氣流吹干加入HPLC用流動相0.1ml

分析樣品目前五十四頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點五、導(dǎo)致待測物損失的因素

吸附：

原因之一：玻璃表面或橡膠塞會吸附藥物，特別是脂肪胺類及含硫化合物。

解決方法：

?可采用硅烷化減少玻璃表面的吸附性?非極性提取溶劑中加入少量極性溶劑可減少器皿對藥物的吸附。

目前五十五頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點

原因之二：血樣中紅血球和纖維蛋白元凝塊的形成，常能引起待測物的共沉淀。

解決方法：將全血樣品加入緩沖液后再行提取。

?這樣血球散開，藥物可從血球表面解吸，以減少共沉淀的損失。

?緩沖液的一定離子強度，可蛋白質(zhì)變性時形成疏松的絮狀物，這樣可減少藥物的物理性滯留和共沉淀的損失。

目前五十六頁\總數(shù)六十四頁\編于二十二點化學(xué)降解：原因：

?樣品的化學(xué)和生物學(xué)不穩(wěn)定性常引起化學(xué)分解?光化學(xué)及熱穩(wěn)定性（尤其在凈化步驟中強酸、強堿的中和所產(chǎn)生的熱）引起的損失，也應(yīng)加注意。解決方法：盡量采用溫和條件制備樣品，經(jīng)免引起藥物的部分分解、開環(huán)等情況發(fā)生，有的樣品尚需避光操作目前五十七