細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)課件 2015免疫細(xì)胞化學(xué)

了解一個基因在組織和細(xì)胞里是否表達(dá)、以及表達(dá)水平的高低,可以用的技術(shù)有哪些？WesternBlotting?RT-PCR?定位？哪種細(xì)胞?哪些細(xì)胞器?

細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

cytochemistry

組織化學(xué)技術(shù)histochemistry

聯(lián)系方式：李貴蘋電話：776402地址：西7號樓103郵箱：pingerli@126.com什么是細(xì)胞化學(xué)？檢測和分析細(xì)胞的化學(xué)組成細(xì)胞打碎，化學(xué)成分釋放。不是細(xì)胞化學(xué)技術(shù)！什么是細(xì)胞化學(xué)？在原位檢測和分析細(xì)胞的化學(xué)組成，保持原有結(jié)構(gòu)和位置。哪種細(xì)胞?哪些細(xì)胞器?

細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整的條件下，借助細(xì)胞中的化學(xué)反應(yīng)在原位確定化學(xué)成分在組織、細(xì)胞和細(xì)胞器各個水平的的分布情況及這些成分在細(xì)胞活動過程中的動態(tài)變化的技術(shù)，用以闡明細(xì)胞化學(xué)成分、結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。

1.保持細(xì)胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)；2.防止細(xì)胞的自溶，以防抗原擴(kuò)散；3.細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固;4.保持組織或細(xì)胞化學(xué)成分的某些屬性,如抗原性或核酸雜交活性。固定（Fixation)特點1.原位：怎樣做到組織/細(xì)胞的原位？方法：固定劑Ⅰ類：醛類，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。

Ⅱ類：氧化劑類，四氧化鋨（奧酸），高錳酸鉀，重鉻酸鉀等。

Ⅲ類：蛋白變性類，甲醇，乙醇，醋酸等。

Ⅳ類：其他，氯化汞，苦味酸等。

根據(jù)組織類型，選擇合適的固定劑

特點2.細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)及可見性

酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

原位雜交技術(shù)放射自顯影技術(shù)酶+底物反應(yīng)顯色反應(yīng)抗原+抗體反應(yīng)顯色反應(yīng)放射性同位素衰變和射線的釋放反應(yīng)感光核酸雜交反應(yīng)顯色反應(yīng)定性、定位分析定量分析特點3.細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的觀察顯微鏡

流式石蠟包埋或冷凍切片（保持原位）組織細(xì)胞固定化學(xué)反應(yīng)顯色反應(yīng)

細(xì)胞化學(xué)技術(shù)通用流程3.技術(shù)的靈敏度和特異性、問題的解決（troubleshooting)靈敏度(Sensitivity):是否有信號特異性(Specificity):信號是否特異2.技術(shù)的基本原理1.技術(shù)的適用范圍學(xué)習(xí)和應(yīng)用細(xì)胞化學(xué)技術(shù)應(yīng)注意的方面免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

是利用免疫化學(xué)反應(yīng)來定位組織細(xì)胞中特異大分子的一類技術(shù)。Immunocytochemistry(ICC)免疫組織化學(xué)（免疫組化)Immunohistochemistry(IHC)1.組織細(xì)胞中的特異分子均可作為抗原,因而該技術(shù)可用來檢測幾乎所有大分子的定位。應(yīng)用范圍：2.也可用在其他細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的顯示反應(yīng)中。

一、抗原

二、抗體

三、免疫反應(yīng)的特異性

四、免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)

五、標(biāo)記物及其在光鏡和電鏡下可見性第一節(jié)免疫細(xì)胞化學(xué)原理

凡能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體并能與抗體特異結(jié)合的物質(zhì)稱為抗原。

一、抗原

細(xì)胞中具有抗原性的化學(xué)成分有：

蛋白質(zhì)多肽脂蛋白多糖脂多糖糖蛋白核蛋白等

這些生物大分子都能用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測嗎?

從生物學(xué)功能來看都包括了哪些物質(zhì)?

酶、受體、抗體、細(xì)胞外基質(zhì)、激素、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、病原體等它們都可以用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)來檢測。

二、抗體*Fab片段：結(jié)合抗原決定與抗原結(jié)合的特異性（抗體活性）

*

Fc片段：結(jié)合抗種屬抗體同種型抗原性的抗原決定簇，（“抗原性”活性）

FcFab兩種“結(jié)合力”識別一抗的種屬特異性，并能夠因此結(jié)合一抗,稱為二抗(抗種屬抗體)?！耙豢?、二抗”二抗(secondaryantibody)一抗(primaryantibody)：識別特異抗原抗原(antigen)

兩類抗體

多克隆抗體—

抗血清，是用提純的抗原免疫動物后從動物血清制備得到的。特點：可自行制備；靈敏度高；特異性較差

單克隆抗體—

由單個產(chǎn)生特異抗體的Ｂ淋巴細(xì)胞擴(kuò)增的細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體。特點：特異性高

兼顧靈敏度，特異性免疫反應(yīng)的特異性表現(xiàn)在：

抗原作為一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子能刺激機(jī)體產(chǎn)生對其特異的抗體并與抗體發(fā)生反應(yīng)

抗體針對某種抗原分子而產(chǎn)生，特異地識別該抗原并與其結(jié)合三、免疫反應(yīng)的特異性

組織抗原＋標(biāo)記抗體標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物免疫反應(yīng)顯色反應(yīng)

四、免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)

把組織細(xì)胞中的特異分子作為抗原,用各種在顯微鏡下可見的標(biāo)記物標(biāo)記特異抗體或者標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，使免疫化學(xué)反應(yīng)具有可見性,間接地顯示抗原,達(dá)到在細(xì)胞或細(xì)胞器水平定位特異分子的目的。

免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)原理

直接法直接標(biāo)記第一抗體

兩種方法：直接法和間接法

間接法標(biāo)記第二抗體或復(fù)合物直接法與間接法

直接法組織抗原直接與標(biāo)記的特異抗體（一抗）反應(yīng)間接法組織抗原與未標(biāo)記的特異抗體（一抗）反應(yīng)一抗再作為抗原與標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)★不必對一抗作標(biāo)記★避免標(biāo)記造成對抗體與抗原結(jié)合的影響★標(biāo)記物多，信號增強(qiáng)

直接法直接標(biāo)記第一抗體

間接法標(biāo)記第二抗體或復(fù)合物五、標(biāo)記物及其在光鏡和電鏡下的可見性

標(biāo)記物

使抗體或抗原抗體復(fù)合物在各種顯微鏡下可見的物質(zhì)。1.熒光2.酶3.親和物質(zhì)4.膠體金顆粒

免疫熒光技術(shù)熒光2.酶3.親和物質(zhì)4.膠體金顆粒根據(jù)標(biāo)記物，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可分為：免疫酶技術(shù)免疫親和技術(shù)免疫膠體金技術(shù)

免疫熒光技術(shù)將熒光素作為標(biāo)記物，使組織細(xì)胞中形成的抗原抗體復(fù)合物在熒光顯微鏡下可見，從而顯示抗原物質(zhì)的定位。

（一）免疫熒光技術(shù)

熒光素：能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的一類化合物。在激發(fā)光的照射下，能發(fā)出較激發(fā)光波長更長的可見光（發(fā)射光），在顯微鏡下可見，并隨照射停止而消失。熒光顯微鏡：熒光顯微鏡的光源提供各種激發(fā)光，使受檢標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)出發(fā)射光.（應(yīng)用熒光染料時都需要知道2個波長：excitationwavelength,emissionwavelength)

如:１.異硫氰酸熒光素(

FITC)

ex:490nm,es:520-530綠色

２.四乙基羅達(dá)明

ex:570nm,es:595nm明亮的橙色

３.四甲基異硫氰酸羅達(dá)明ex:550nm,es:620nm橙紅色

４.藻紅蛋白(PE)

多種，橙黃-紅色

熒光素

海馬細(xì)胞

微管蛋白綠色(胞體、樹突)

軸突終末蛋白紅色(突觸)

共定位黃色A549細(xì)胞人骨肉瘤細(xì)胞牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞紅色：線粒體綠色：溶酶體藍(lán)色：細(xì)胞核紅色：線粒體綠色：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紫色：細(xì)胞膜紅色：線粒體綠色：高爾基1.雙重或多重標(biāo)記，同時比較不同分子的位置及量的關(guān)系。2.雙重或多重標(biāo)記，同時染色細(xì)胞器和感興趣分子，可顯示分子的亞細(xì)胞定位信息。3.根據(jù)熒光素的強(qiáng)度，進(jìn)行半定量分析。免疫熒光技術(shù)優(yōu)點：

是將酶作為標(biāo)記物使組織細(xì)胞中形成的抗原抗體復(fù)合物得到標(biāo)記，再通過酶細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生顯微鏡下可見的顯色物質(zhì)，間接顯示抗原物質(zhì)的定位。普通光學(xué)顯微鏡即可觀察

（二）免疫酶技術(shù)酶抗原一抗二抗酶標(biāo)二抗酶—抗酶抗體復(fù)合物抗酶抗體酶標(biāo)抗體法抗酶抗體法

復(fù)合物法酶標(biāo)記的三種形式：信號的放大一抗二抗抗酶抗體一抗二抗抗酶抗體復(fù)合物一抗二抗

常用的標(biāo)記酶：

辣根過氧化物酶

2.堿性磷酸酶外源的酶，與細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源酶應(yīng)該有明顯區(qū)別.兩種方法：

(1)過氧化物酶標(biāo)記抗體

(2)過氧化物酶-抗過氧化物酶復(fù)合物法（Peroxidase-Antiperoxidase,PAP）

１.辣根過氧化物酶（hoseradishperoxidase,HRP）

底物：DAB(二氨基聯(lián)苯胺)光鏡下：棕黃色;DAB經(jīng)鋨酸固定后能生成鋨黑,電鏡下呈現(xiàn)高電子密度.

HRP

H2O2

H2O

nDAB鋨酸

鋨黑（高電子密度）DAB氧化聚合物(棕黃色)

顯示辣根過氧化物酶（HRP）

２.堿性磷酸酶（Alkalinephosphotase,AKP）兩種方法：

(1)堿性磷酸酶標(biāo)記抗體

(2)堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶復(fù)合物法（APAAP）（Alkalinephosphotase－Antialkalinephosphotase）

b.底物：萘酚衍生物，捕捉底物：固紅或固藍(lán)產(chǎn)物：紅或藍(lán)色偶氮色素

APBCIP藍(lán)紫色色素NBT

a.底物:吲哚酚酯BCIP，捕捉底物：四唑鹽NBT，產(chǎn)物：藍(lán)紫色

顯示堿性磷酸酶(AP)

1.反應(yīng)后標(biāo)本材料可長期保存。2.觀察定位信息時，可觀察感興趣分子在細(xì)胞整體中的相對定位，顏色對比清晰。3.同時觀察陽性信號和陰性信號。4.能用于電鏡觀察。免疫酶技術(shù)優(yōu)點：親和物質(zhì)：具有多價能力的物質(zhì)，與另一種親和物質(zhì)有高度親和力，又能與抗體、蛋白質(zhì)及各種標(biāo)記物(熒光素、酶、膠體金等)結(jié)合。最常用的親和物質(zhì)系統(tǒng)：

1、生物素（biotin）-親和素（avidin）結(jié)合能力強(qiáng)，結(jié)合不可逆

2、葡萄球菌A蛋白-免疫球蛋白IgG

（三）免疫親和技術(shù)通常在光鏡下觀察

(1)標(biāo)記親和素－生物素技術(shù)（Labeledavidinbiotin,LAB）

標(biāo)記鏈球菌親和素-生物素技術(shù)

（LabeledStreptoavidinbiotin,LSAB）

(2)橋式親和素－生物素技術(shù)（Bridgedavidinbiotin,BAB）

(3)親和素－生物素-酶復(fù)合物技術(shù)

（Avidin-biotinperoxidasecomplexmethod，ABC）1.生物素系統(tǒng)標(biāo)記技術(shù)的基本方法生物素化酶生物素化抗體親和素—生物素

—酶復(fù)合物生物素親和素

標(biāo)記鏈球菌親和素-生物素技術(shù)

Labeledstreptoavidinbiotin（LSAB)①→②→③→Hsp90在肝癌組織中的表達(dá)(LSAB法)

親和素－生物素-酶復(fù)合物技術(shù)（ABC）

親和素-生物素-HRP①一抗②二抗生物素化③

復(fù)合物抑癌基因產(chǎn)物P16位于垂體腺瘤細(xì)胞核

葡萄球菌A蛋(StaphylocalproteinA,SPA)

◆是金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁含有的一種蛋白簡稱為A蛋白或蛋白A

◆SPA能與人及多種哺乳動物血清中IgG呈非特異性結(jié)合又能與標(biāo)記物結(jié)合

經(jīng)標(biāo)記的SPA可代替相應(yīng)標(biāo)記的二抗2.葡萄球菌A蛋白與IgG系統(tǒng)（四）免疫膠體金技術(shù)以電鏡下可見的膠體金作為抗體或蛋白Ａ的標(biāo)記物，間接顯示組織細(xì)胞中特異分子的技術(shù)。

通常在電鏡下觀察

金標(biāo)抗體或金標(biāo)A蛋白

1、亞細(xì)胞定位（超微結(jié)構(gòu)定位）。2、采用不同大小的金顆粒(通常5-20nm)，標(biāo)記不同抗體或A蛋白，達(dá)到雙重甚至多重標(biāo)記，定位多種抗原的目的。

免疫膠體金技術(shù)優(yōu)點：X蛋白定位于核仁

1.免疫熒光技術(shù)

2.免疫酶技術(shù)

3.免疫親和技術(shù)

4.免疫膠體金技術(shù)

標(biāo)記物

使抗體或抗原抗體復(fù)合物在各種顯微鏡下可見的物質(zhì)總結(jié)：

免疫細(xì)胞化學(xué)方法有:直接法、間接法間接法中有:二抗、三抗或復(fù)合物

標(biāo)記系統(tǒng)有:熒光素、酶、親和素、膠體金觀察方法有:熒光顯微鏡、普通光鏡、電鏡總結(jié)：

基本過程:固定（組織脫水、包埋、切片） ↓ 免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)：抗原與抗體 ↓ 標(biāo)記系統(tǒng)反應(yīng)

免疫細(xì)胞化學(xué)方法（略）

簡要過程:固定（組織脫水、包埋、切片）

通透（permeability)封閉(blocking)一抗孵育（primaryantibody)漂洗 二抗孵育（secondaryantibody) 漂洗顯色

JMJD2B在結(jié)腸癌中的表達(dá)HRP標(biāo)記抗體靈敏度：高特異性：好2.陽性程度有差異++：%+：%-：%3.核質(zhì)分布有差異