臨床微微生物標(biāo)本的采集注意事項(xiàng)接種及涂片染色優(yōu)秀課件

臨床微微生物標(biāo)本的采集注意事項(xiàng)接種及涂片染色1第一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五一、標(biāo)本采集和運(yùn)送標(biāo)本采集和運(yùn)送是細(xì)菌培養(yǎng)成功的最最重要的環(huán)節(jié)但由于標(biāo)本的采集和運(yùn)送常有護(hù)士或醫(yī)生或病人自己完成，所以也是最不容易做好的事情，而且不知道問題所在之處，造成的后果是：陽性率低、標(biāo)本污染（臨床最不能接受的問題）第二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五（一）痰標(biāo)本的采集1、標(biāo)本采集時(shí)間：用抗生素前2、標(biāo)本采集方法：2.1吸痰：通過氣管切口直接將痰吸出，只適用于氣管切開患者。2.2雙套管毛刷防污染吸痰（PSB）：這是最好、最科學(xué)的取樣方法，但缺點(diǎn)是有創(chuàng)傷性檢查，病人不易接受。2.3肺泡灌洗液：對(duì)肺心病、呼衰病人有一定的危險(xiǎn)。2.4咳痰：是最簡(jiǎn)單的方法，但污染嚴(yán)重，影響結(jié)果判斷。第三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五（二）泌尿標(biāo)本的采集1、采集后的標(biāo)本應(yīng)立即送檢。2、采集時(shí)間：多數(shù)藥物從尿道排泄，所以不管用哪種方法都應(yīng)在用藥前采集。應(yīng)采集早晨第一次的尿。3、標(biāo)本管不應(yīng)含防腐劑和消毒劑。4、采集中段尿時(shí)要先用肥皂清洗女性的外陰和男性的外生殖器包括包皮內(nèi)，然后用清水沖洗。5、長(zhǎng)期留置導(dǎo)尿管的患者應(yīng)在更換新管時(shí)留取尿標(biāo)本。第四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五（三）分泌物的采集1、對(duì)開放性病灶的采集：如眼結(jié)膜膿性分泌物、扁桃體、外耳道、手術(shù)后切口、導(dǎo)管治療感染、瘺管內(nèi)膿液、生殖道分泌物等均屬于開放性病灶。應(yīng)先用滅菌生理鹽水沖洗表面污染菌，去除舊的分泌物，用滅菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的組織送檢。第五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五（三）分泌物的采集2、閉鎖性膿腫：如淋巴膿腫、肺膿腫、肝膿腫、腹腔膿腫、盆腔膿腫等，對(duì)封閉的膿腫常采用穿刺或引流的的方法采樣，應(yīng)在用藥前采集，應(yīng)注意膿液的氣味、性狀、顏色注意厭氧菌存在的可能。不能及時(shí)送檢應(yīng)運(yùn)用輸送培養(yǎng)基。第六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五（四）便標(biāo)本的采集1、采集時(shí)間：腹瀉患者應(yīng)在用藥前、急性期采集；沙門菌感染、腸熱癥應(yīng)在2周內(nèi)采；厭氧菌出現(xiàn)癥狀即采集。2、采集方法：自然排便者可用小木棒挑取有膿血和黏液的部位的糞便2-3克，如液狀糞便取絮狀物盛于無菌的、密封的、不吸水的、容器內(nèi)或直接盛于增菌液或保存液中；對(duì)不易獲得糞便患者及幼兒，可用直腸拭子采集后置保存液或輸送培養(yǎng)基中送檢。第七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五3、注意事項(xiàng)⑴雖然糞便標(biāo)本本身含很多細(xì)菌但也要用無菌容器。⑵在患者病情許可的條件下應(yīng)在用藥前采集標(biāo)本。⑶應(yīng)床邊接種或置輸送培養(yǎng)基送檢。⑷厭氧細(xì)菌（難辯梭菌）培養(yǎng)的標(biāo)本應(yīng)盡量減少與空氣接觸。第八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五（五）血液及骨髓標(biāo)本的采集1、采血時(shí)間：盡可能在用抗生素前，心內(nèi)膜炎例外。2、采血量：采一次或采一瓶是錯(cuò)誤的，至少應(yīng)采一套2瓶，分需氧和厭氧。2瓶血量不少于16-20ml，先將10ml注入需氧瓶，再將剩余血采血注入?yún)捬跗俊?、采血方法：不要與血?dú)夂脱翗?biāo)本一起采血；不推薦血入瓶前換針頭；不推薦靜脈血直接入瓶；不宜在靜脈導(dǎo)管或靜脈留置口采血。第九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五（五）血液及骨髓標(biāo)本的采集4、采血間隔：如第一次采集2套（4瓶）血培養(yǎng)標(biāo)本，在以后的2-5天不必采血，但除外心內(nèi)膜炎和導(dǎo)管相關(guān)性敗血癥。5、兒童：采血量是總血量的1%。6、延遲培養(yǎng)瓶處理:延遲培養(yǎng)瓶不要放冰箱或孵箱，放常溫，盡早送往臨床細(xì)菌室。7、皮膚消毒液推薦：建議先用70-80%異丙醇去脂，再用葡萄糖酸氯乙定消毒。第十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五關(guān)于夜班血培養(yǎng)的送檢培養(yǎng)瓶夜班未能及時(shí)送到檢驗(yàn)科，存在室溫即可，不能冷藏也不能放入35℃的溫箱。過夜不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響，但仍需盡快送檢。冷藏可能導(dǎo)致對(duì)溫度敏感的耐瑟氏菌等死亡。溫箱會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，從而錯(cuò)過檢測(cè)的最佳時(shí)期。第十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五血標(biāo)本采集間隔時(shí)間對(duì)于非持續(xù)性菌血癥，同時(shí)或短時(shí)間內(nèi)采集2－3套血培養(yǎng)，因?yàn)轶w內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬系統(tǒng)會(huì)在15～30min內(nèi)清除掉進(jìn)入人體內(nèi)的細(xì)菌?？梢杉毙孕膬?nèi)膜炎患者要立即取血作血培養(yǎng)，30分鐘內(nèi)完成3套血培養(yǎng)的采集，采集后立即進(jìn)行抗菌藥的經(jīng)驗(yàn)治療。如果24小時(shí)內(nèi)報(bào)告陰性，則繼續(xù)采集2套血培養(yǎng)。第十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五血標(biāo)本采集間隔時(shí)間可疑的亞急性心內(nèi)膜炎患者每間隔30分鐘至1h采集1套，連續(xù)采集3套標(biāo)本。如果24小時(shí)內(nèi)報(bào)告陰性，則繼續(xù)采集2套血培養(yǎng)。第十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五抽血量和體重的關(guān)系2-340-60>=36.322012.8-36.3262.1-12.7241.1-211-2<1套（需氧+厭氧）抽血量ml體重Kg第十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五腦脊液標(biāo)本的采集無菌操作，由醫(yī)生腰椎穿刺采樣最少1mL，最好>5mL打入3個(gè)小管中，以第一根小管送檢培養(yǎng)即時(shí)送檢，一般不能超過1小時(shí)。絕對(duì)不能冷藏！第十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五二、樣本拒收標(biāo)準(zhǔn)

1、樣本上無病患標(biāo)簽或病患標(biāo)簽與檢驗(yàn)申請(qǐng)單不符合。2、樣本以不適當(dāng)?shù)臏囟?、運(yùn)送培養(yǎng)基及容器送。3、樣本的量不足、已被防腐劑固定和運(yùn)送時(shí)間過長(zhǎng)。4、樣本外漏、容器破損及明顯受污染的樣本。5、樣本的檢驗(yàn)項(xiàng)目申請(qǐng)不適合進(jìn)行。

第十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五二、樣本拒收標(biāo)準(zhǔn)6、當(dāng)日重復(fù)送樣本（除血液培養(yǎng)外）。7、痰標(biāo)本涂片，白細(xì)胞<10，上皮細(xì)胞

>25。8、尿液標(biāo)本培養(yǎng)，標(biāo)本量太少（少于

10ml）。9、糞標(biāo)本培養(yǎng)，放置時(shí)間過長(zhǎng)，已干。

第十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五

三、分離培養(yǎng)基本操作規(guī)范合格的標(biāo)本是保證培養(yǎng)成功的重要條件，但如果沒有適宜的分離培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境以及正確的處理方法同樣不能獲得好的結(jié)果，為此制定如下基本操作規(guī)范以保證致病細(xì)菌分離成功。第十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五

（一）平板的劃線分離方法第十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五1、分區(qū)劃線分離法圖示第二十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五2、連續(xù)劃線分離法第二十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五3、Maki滾動(dòng)法第二十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五錯(cuò)誤涂法第二十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五（二）正確的培養(yǎng)基放置方法1、加蓋、倒置（底朝上）3、放置于合適的培養(yǎng)環(huán)境2、不可疊加太高（不超過4個(gè)）

第二十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五

（三）各種標(biāo)本的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件第二十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五1、痰標(biāo)本⑴培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、中國(guó)蘭瓊脂。⑵培養(yǎng)環(huán)境：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、置5-7%CO2、35℃環(huán)境培養(yǎng)，其他培養(yǎng)基置35℃空氣培養(yǎng)。⑶真菌培養(yǎng)：沙保弱瓊脂培養(yǎng)基，28℃空氣培養(yǎng)。第二十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五2、尿標(biāo)本⑴

培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、中國(guó)蘭。⑵

菌落計(jì)數(shù)：每個(gè)標(biāo)本都要做，用加樣器或定量接種環(huán)取樣本10ul分別接種于上述培養(yǎng)基均勻涂布整個(gè)平皿，次日作菌落計(jì)數(shù)。⑶

培養(yǎng)環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)第二十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五3、大便標(biāo)本⑴

培養(yǎng)基：中國(guó)蘭、SS瓊脂。⑵培養(yǎng)環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。⑶疑似偽膜性腸炎：5%羊血瓊脂、沙保弱瓊脂，5%羊血瓊脂置35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。沙保弱瓊脂置28℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。其他特殊腸道致病菌培養(yǎng)按國(guó)家CDC要求執(zhí)行。

第二十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五4、分泌物標(biāo)本⑴

培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、中國(guó)蘭。⑵培養(yǎng)環(huán)境：35℃，空氣環(huán)境培養(yǎng)。第二十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五5、靜脈導(dǎo)管尖端標(biāo)本靜脈導(dǎo)管尖端：培養(yǎng)靜脈導(dǎo)管尖端是為了明確細(xì)菌來源。最常用的方法是半定量的方法，方法是用5cm長(zhǎng)的導(dǎo)管末端部分在血液瓊脂平板上滾動(dòng)4次。培養(yǎng)物出現(xiàn)15個(gè)以上的菌落，提示有潛在的導(dǎo)管相關(guān)性感染。第三十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五導(dǎo)管尖端陽性培養(yǎng)結(jié)果第三十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五6、腦脊液標(biāo)本⑴

培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、葡萄糖肉湯⑵

培養(yǎng)環(huán)境：置5%CO2、35℃環(huán)境培養(yǎng)。第三十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五7、膽汁或胸水或腹水標(biāo)本⑴

培養(yǎng)基：如標(biāo)本量大時(shí)可按血液培養(yǎng)方法直接取16-20ml分別種入需氧和厭氧培養(yǎng)瓶。如標(biāo)本量有限，可接種5%羊血瓊脂、中國(guó)蘭、葡萄糖肉湯。。⑵

培養(yǎng)環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。第三十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五8、膿液標(biāo)本⑴培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、中國(guó)蘭。⑵培養(yǎng)環(huán)境：35℃，空氣環(huán)境培養(yǎng)。第三十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五9、生殖道標(biāo)本普通細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本接種：

⑴培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂。⑵培養(yǎng)環(huán)境：35℃，空氣環(huán)境培養(yǎng)。淋球菌標(biāo)本的接種：

⑴培養(yǎng)基：接種于專用MTM平皿上。⑵培養(yǎng)環(huán)境：置5%CO2、35℃環(huán)境培養(yǎng)。第三十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五四、細(xì)菌涂片操作規(guī)范第三十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五涂片干燥固定染色水洗、吸干鏡檢1、染色一般程序制備涂片標(biāo)本→染色第三十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五2、固定的目的和方法使細(xì)菌的細(xì)胞凝固，使菌體與玻片粘得更牢固可改變菌體對(duì)染料的通透性加熱固定可殺死細(xì)菌，比較安全固定的方法將制成的標(biāo)本勻速通過火焰三次第三十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五3、染色應(yīng)具備最基本的染色技術(shù)，即革蘭氏染色、抗酸染色和墨汁染色。⑴

革蘭染色：革蘭染色報(bào)告必須包括染色反應(yīng)或微生物種類和類別，描述物種的形態(tài)或結(jié)構(gòu)。如革蘭染色見到革蘭陽性球菌，呈葡萄狀排列；又如革蘭染色見到真菌小分生孢子及菌絲。第三十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五革蘭染色原理細(xì)菌的等電點(diǎn)較低，約在pH2～5之間，故在中性、堿性或弱堿性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶負(fù)電荷，易與帶正電荷的堿性染料如龍膽紫及堿性復(fù)紅等結(jié)合，使細(xì)菌被染成紫色或紅色。第四十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五①龍膽紫液染10s（染料著染）→水洗

②碘溶液染10s（媒染劑媒染）→水洗

③丙酮酒精脫色10~20s（脫色劑）→水洗

④稀釋的石炭酸復(fù)紅10s（復(fù)染）→水洗

→干燥→鏡檢。

革蘭氏染色步驟第四十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五革蘭氏染色注意事項(xiàng)

①革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被染成革蘭氏陽性菌。②菌齡也有影響。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。

③不要涂片太厚，會(huì)造成假陰性或假陽性。第四十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五

紅色革蘭陰性菌、紫色革蘭陽性菌第四十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五鏈狀的革蘭陽性球菌：提示鏈球菌短鏈，<6個(gè)細(xì)胞，提示腸球菌或B群鏈球菌；肺炎鏈球菌血培養(yǎng)中長(zhǎng)鏈的革蘭陽性球菌（>6個(gè)細(xì)胞）提示化膿鏈球菌或草綠色鏈球菌革蘭氏陽性球菌第四十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五呈堆或四聯(lián)排列的革蘭陽性球菌提示葡萄球菌

革蘭氏陽性球菌第四十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五革蘭氏陰性球菌第四十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五外型奇特的酵母菌，不要遺忘革蘭陰性桿菌。第四十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五痰鏡檢的判斷標(biāo)準(zhǔn)：痰培養(yǎng)標(biāo)本實(shí)驗(yàn)室在接種前必須作痰涂片革蘭染色，當(dāng)在低倍鏡下白細(xì)胞≤10個(gè)／L、上皮細(xì)胞≥25個(gè)／L時(shí)應(yīng)作為不宜做培養(yǎng)的標(biāo)本；當(dāng)白細(xì)胞≤10個(gè)／L，上皮細(xì)胞≤25個(gè)／L時(shí)再參照油鏡觀察標(biāo)本中細(xì)菌分布作出判斷。第四十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五痰鏡檢的判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)標(biāo)本中細(xì)菌種類超過3種以上，未見到釬毛拄狀上皮細(xì)胞，作為不合格標(biāo)本；如見到數(shù)量不等的白血胞或釬毛拄狀上皮細(xì)胞或兩者同在，含1-2種不同細(xì)菌，可考慮繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果可根據(jù)病情再作分析；當(dāng)涂片中見到1-3種細(xì)菌，少量的扁平上皮細(xì)胞，少量或較多釬毛拄狀上皮細(xì)胞均可按合格標(biāo)本繼續(xù)培養(yǎng)。第四十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五痰鏡檢的判斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）膿細(xì)胞>+++，鱗狀上皮細(xì)胞≤+，細(xì)菌種類<3種，可視為理想的痰標(biāo)本。無膿細(xì)胞或膿細(xì)胞極少時(shí)，以見到柱狀上皮細(xì)胞為準(zhǔn)。（2）膿細(xì)胞>+++，<++鱗狀上皮細(xì)胞≥+，細(xì)菌種類<3種，也可用于培養(yǎng)。（3）膿細(xì)胞<+，鱗狀上皮細(xì)胞>+++，細(xì)菌種類>4種，視為不合格標(biāo)本，應(yīng)予以退回，重新送檢。第五十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五用革蘭氏染色來評(píng)估呼吸道標(biāo)本是否合格>10鱗狀上皮細(xì)胞/LPF——拒收！彈性纖維，中性粒細(xì)胞多，鱗狀上皮細(xì)胞少，有代表性的好標(biāo)本第五十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五纖毛拄狀上皮細(xì)胞第五十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌第五十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五⑵抗酸染色抗酸染色報(bào)告應(yīng)顯示找到或未找到或可疑抗酸桿菌三種結(jié)果，報(bào)告中應(yīng)以加號(hào)體現(xiàn)標(biāo)本中抗酸桿菌的存在量。如找到抗酸桿菌++；見到染色不典型抗酸桿菌+，建議再送標(biāo)本。不能報(bào)告找到結(jié)核桿菌但可報(bào)告未找到結(jié)核桿菌第五十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五

抗酸染色染色步驟①初染：用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時(shí)離開，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，加熱3-5分鐘，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。也可不加熱染色5分鐘或更久，用水沖洗。②脫色：3%鹽酸酒精脫色1~2分鐘，用水沖洗。③復(fù)染：用亞甲基藍(lán)溶液復(fù)染30s~1分鐘，用水沖洗后用吸水紙吸干。第五十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五

抗酸染色注意事項(xiàng)①無菌操作②涂片厚度要適中③

染色時(shí)間要充分④脫色是關(guān)鍵步驟，要徹底⑤初染加熱勿沸騰勿干涸。第五十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五形態(tài)：細(xì)長(zhǎng)，略彎曲的桿菌，常堆積成團(tuán)，排列無序，偶可見呈分枝狀生長(zhǎng)，無鞭毛和芽胞。染色性：不易著色，抗酸染色陽性。菌體呈紅色，背景及非抗酸性細(xì)菌呈蘭色。結(jié)核分枝桿菌第五十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五結(jié)核分枝桿菌第五十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五結(jié)核分枝桿菌第五十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五結(jié)核分枝桿菌第六十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五涂片結(jié)果報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)陰性300視野0條報(bào)告菌數(shù)300視野1～8條陽性1＋100視野3～9條陽性2＋10視野1～9條陽性3＋每視野1～9條陽性4＋每視野>10條第六十一頁，