第十章酶在食品分析中的應用

酶法分析的發(fā)展酶在定量分析中的應用可以追溯到19世紀中期。當時，曾采用麥芽提取物作為過氧化物酶源，以愈創(chuàng)木酚作為共底物或指示劑測定過氧化氫。然而，酶法分析真正的發(fā)展應歸于它在臨床實驗室中的廣泛應用。目前一頁\總數(shù)四十七頁\編于八點酶法分析的發(fā)展如早在1914年臨床上就開始采用脲酶測定尿中的尿素，但是在臨床實驗室中酶分析的真正突破要推遲到1958年，當時轉氨酶分析發(fā)展成為診斷肝病和心臟病的一個有效手段。到了20世紀50年代前已有60種物質能借助于酶法分析。近年來，酶法分析發(fā)展迅速，廣泛應用于臨床檢驗、食品、環(huán)境等生物及其它樣品的檢測。目前二頁\總數(shù)四十七頁\編于八點1.酶法分析的特點及應用類型酶的特性酶法檢測的特點催化效率高專一性靈敏性強快速特異性、準確不需要物理分離，干擾少目前三頁\總數(shù)四十七頁\編于八點酶在食品分析中的應用類型1）去除樣品中的雜質。如測定果糖、多糖等。2）催化待測物生成新的產物，而這種產物更容易被定量分析。如：淀粉的測定。3）測定食品中酶的活性作為食品的指標，如過氧化物酶的測定、蜂蜜中酶的測定。4）利用酶催化反應所產生的一些信息。如酶聯(lián)免疫法、酶電極法等。目前四頁\總數(shù)四十七頁\編于八點2酶聯(lián)免疫測定（ELISA）酶聯(lián)免疫測定（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）是繼放射免疫測定技術之后發(fā)展起來的一項新的免疫學技術。ELISA自上世紀70年代出現(xiàn)開始，就因其高度的準確性、特異性、適用范圍寬、檢測速度快以及費用低等優(yōu)點，在臨床和生物疾病診斷與控制等領域中倍受重視，成為檢驗中最為廣泛應用的方法之一。目前五頁\總數(shù)四十七頁\編于八點2.1ELISA的基本原理（1）利用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接（或建立關聯(lián)）。（2）通過酶與底物產生顏色反應，用于定量測定。它將酶促反應的高效率和免疫反應的高度專一性有機地結合起來，可對生物體內各種微量有機物的含量進行測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。重點目前六頁\總數(shù)四十七頁\編于八點ELISA試劑盒的組成完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：（1）包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標記的抗原或抗體（標記物）；（3）酶作用的底物（顯色劑）；（4）陰性和陽性對照品（定性測定），參考標準品和控制血清（定量測定）；（5）結合物及標本的稀釋液；（6）洗滌液；（含吐溫20磷酸鹽緩沖液）（7）酶反應終止液。（常用硫酸）必需目前七頁\總數(shù)四十七頁\編于八點酶標儀和酶標板DNM-9602A酶標分析儀酶標板目前八頁\總數(shù)四十七頁\編于八點2.2ELISA的基本類型隨著ELISA在生物檢測分析領域的廣泛應用，根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，逐漸演變出了幾種不同類型的檢測方法：（5）捕獲法測IgM抗體；（6）ABS-ELISA法；（7）PCR-酶聯(lián)免疫測定法；（8）斑點免疫酶結合試驗。（1）夾心法；（2）間接法；（3）競爭法；（4）雙位點一步法；目前九頁\總數(shù)四十七頁\編于八點雙抗體夾心法此法常用于測定抗原,將已知抗體吸附于固相載體,加入待檢標本(含相應抗原)與之結合。溫育后洗滌，加入酶標抗體和底物進行測定。（1）雙抗體夾心法乙肝表面抗原。目前十頁\總數(shù)四十七頁\編于八點間接法此法是測定抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標本(含相應抗體)與之結合。洗滌后，加入酶標抗球蛋白抗體(酶標抗抗體)和底物進行測定。（2）間接法ELISA目前十一頁\總數(shù)四十七頁\編于八點競爭法此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以測定抗原為例,將抗原吸附于固相載體；加入待測抗原和一定量特異性抗體，使固相抗原與待測抗原二者競爭與抗體結合；經過洗滌分離，最后結合于固相的抗體與待測抗原含量呈負相關。（3）競爭法黃曲霉素目前十二頁\總數(shù)四十七頁\編于八點2.3ELISA測定中酶的作用由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定具有極高的靈敏度。目前十三頁\總數(shù)四十七頁\編于八點（1）酶標記的抗體或抗原的制備酶標記的抗體或抗原是ELISA中最關鍵的試劑。良好的結合物既保持了酶的催化活性，也保持了抗體或抗原的免疫活性。酶標記抗體的制備主要有戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法兩種方法。酶結合物一般需經離子交換層析或分子篩分離純化。目前十四頁\總數(shù)四十七頁\編于八點（2）常用的酶及底物酶底物顯色反應

測定波長

辣根過氧化物酶鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色黃色棕色蘭色藍綠色492460449

425

642堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色藍色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光黃色

360,450

420

為什么辣根過氧化物酶可應用于elisa？目前十五頁\總數(shù)四十七頁\編于八點為什么辣根過氧化物酶可應用于elisa？（1）成本低（2）熱穩(wěn)定性好（3）顯色反應類型多目前十六頁\總數(shù)四十七頁\編于八點2.4ELISA技術在食品分析中的應用近年來，ELISA因其操作程序的規(guī)范化、簡單化和檢測的高靈敏性，在農藥殘留、獸藥殘留、重要有機物污染、生物毒素、食品添加劑和人畜共患疾病病原體的快速檢測和分析等食品安全性檢測領域正逐步推廣應用。目前十七頁\總數(shù)四十七頁\編于八點（1）毒素檢測真菌毒素是真菌產生的次級代謝產物，其中的十幾種對人類危害較大，它們一般同時具有毒性強和污染頻率高的特點。其中毒性最大、致癌能力最強的是黃曲霉毒素。它在自然界中分布十分廣泛，黃曲霉常常和其他多種微生物在一起，生長在糧食、油料作物的種子、各種食品和飼料中。目前十八頁\總數(shù)四十七頁\編于八點自1977年抗黃曲霉素B1的單克隆問世至今，幾乎所有重要真菌毒素如伏馬毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯酮、展青霉素等的ELISA檢測方法均已建立。在對黃曲霉素B1(AFTB1)的檢測中，其檢測AFTB1的線性范圍0.25～5.Oμg/mL，靈敏度為12.5Pg，整個測定過程僅為4h。另外該方法也正在被廣泛地應用于各種藻類和貝類毒素的檢測。目前十九頁\總數(shù)四十七頁\編于八點黃曲霉素B1ELISA試劑盒

本試劑盒包括用于定量檢測黃曲霉素B-G的試劑和方法。檢測數(shù)量：96孔（包括標準）檢測時間：20分鐘目前二十頁\總數(shù)四十七頁\編于八點金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測蘑菇罐頭約占我國罐頭出口量的30％，中國蘑菇罐頭一度占據美國市場2/3份額，1989年以來FDA以我國蘑菇罐頭食品含有金黃色葡萄球菌腸毒素并導致消費者傷害為由，對中國蘑菇罐頭采取”自動扣留措施”。2002年才得以解決。FDA檢測蘑菇罐頭葡萄球菌腸毒素使用的TECRA試劑盒在檢測過程中會產生強烈的非特異反應，因此，這種試劑盒是不可靠的，其所得出的檢測結果也是不可靠的。目前二十一頁\總數(shù)四十七頁\編于八點（2）農藥殘留檢測酶聯(lián)免疫測定已成為許多國際權威分析機構如AOAC分析農藥殘留的首選方法。迄今為止，應用酶聯(lián)免疫測定檢測食品中的殘留農藥主要為除草劑、殺蟲劑和殺菌劑。草甘膦的ELISA檢出下限為0.07μg/mL，與色譜法測定的結果一致。目前二十二頁\總數(shù)四十七頁\編于八點從目前來看，盡管ELISA檢測限度還不能完全達到國外發(fā)達國家技術法規(guī)和限量標準的要求，而且抗體制備不易和不能同時完成多種農藥殘留檢測等缺點，但是由于該技術具有樣本前處理簡單，純化步驟少，大量樣本分析時間短，適合于做成試劑盒現(xiàn)場篩選等優(yōu)點，使其可在蔬菜產區(qū)、蔬菜批發(fā)市場和海關配備，工商人員可隨身攜帶或建立固定的農藥殘留速測點，隨時把殘毒超標的蔬菜、水果杜絕在食用之前。目前二十三頁\總數(shù)四十七頁\編于八點（3）細菌污染檢測食品中的有害細菌數(shù)量達到一定數(shù)目，食用后會引起各種疾病。為了有效地控制其傳播，就必須有快速和可靠的檢測方法。目前有許多種方法，其中通過制備單克隆抗體分析食品中細菌的酶聯(lián)免疫測定技術研究最多，檢測結果準確可靠。目前二十四頁\總數(shù)四十七頁\編于八點沙門氏菌的ELISA檢測例如對沙門氏菌最低檢測量可達500CFU/g，僅需22h，比常規(guī)方法縮短了3～4d，與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌無交叉反應。此外以ELISA技術為基礎的全自動沙門氏菌檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)了整個過程的自動化，全程耗時僅為45min。其原理是將捕捉抗體包被到凹形金屬片的內面，可以從前增菌液中吸附被檢的沙門氏菌，對于該系統(tǒng)來說，需要做的只是加樣。目前二十五頁\總數(shù)四十七頁\編于八點李斯特氏菌的快速檢測在對李斯特氏菌的快速檢測中，利用三株針對單核細胞增生李斯特氏菌、無害李斯特氏菌和西里杰氏李斯特氏菌共同表位的單抗，以夾心ELISA法，在48h內，可從人工模擬肉中檢測下限為5CFU/g樣品。目前二十六頁\總數(shù)四十七頁\編于八點（4）肉類品質檢測ELISA在肉類食品品質檢測中的應用主要包括加熱終溫判定分析和摻入異種肉的檢測兩個方面。腸道疾病的爆發(fā)和動物性食品有很大關系，而肉食品加熱煮制不當是引起該疾病爆發(fā)的一個主要原因。在加熱過程中一些成分的含量會降低，而一些產物的濃度會提高。目前二十七頁\總數(shù)四十七頁\編于八點當用蛋白質做指示劑時，可制備抗體，這種抗體對單一蛋白質的天然狀態(tài)或變性狀態(tài)均具有專一性，這樣它就可以指示蛋白質在加熱過程中變化。因而ELISA可作為商業(yè)上快速判定分析肉品終溫的一種方法。目前用的最多的是對乳酸脫氫酶的免疫檢測。其次是對摻入異種肉的檢測，利用多克隆抗體對血清白蛋白的酶聯(lián)免疫測定法，對鮮肉進行摻假檢測。目前二十八頁\總數(shù)四十七頁\編于八點幾種以單克隆抗體為基礎的ELISA反應已得到應用，可以檢測出1%～2%的摻假率。目前在商業(yè)上，酶聯(lián)免疫測定已可以檢測十多種動物肉，該方法已為美國農業(yè)部使用。同時，ELISA技術也可以利用對熱穩(wěn)定的肌肉抗原來檢測加熱處理后的肉摻假情況。目前，該技術可以檢測6種家畜熟肉制品。目前二十九頁\總數(shù)四十七頁\編于八點（5）動物性食品中藥物殘留檢測利用ELISA技術測定動物性食品中有害殘留成分只是近幾年的事。隨著研究的深入，由原樣品的復雜處理和抽提發(fā)展為只需要高度純化過程，加速了其在實際檢測中的應用。特別是對豬肉、禽肉和水產品中重要禁用獸藥的檢測。目前三十頁\總數(shù)四十七頁\編于八點如瘦肉精（鹽酸克倫特羅）酶聯(lián)免疫檢測法，基于抗原抗體反應進行競爭性抑制測定，不僅可作為一個定性篩選過程，也可以進一步進行定量測定。檢測靈敏度可達到0.5×10-9，完全達到我國農業(yè)部目前的1×10-9監(jiān)督檢測標準。ELISA法作為鹽酸克倫特羅殘留量的篩選方法具有操作簡便、準確快速的特點，適用于大量樣品的測定，并可能成為國家標準檢測方法。目前三十一頁\總數(shù)四十七頁\編于八點（6）人畜共患疾病病原體檢測在禽流感病毒檢測方面，我國已完成了禽流感流行株的分離和鑒定、禽流感重組核蛋白診斷抗原的研制及應用，建立了禽流感免疫酶診斷方法和技術，已形成試劑盒生產能力。此外，采用ELISA法可以有效檢測牛及羊朊病毒蛋白，該蛋白可引起牛的病理性海綿狀病毒，是一種致死性神經系統(tǒng)疾病（瘋牛病，BSE），與人群發(fā)生變異型克雅氏?。╒CJD）有關。目前三十二頁\總數(shù)四十七頁\編于八點（7）重金屬污染檢測金屬硫蛋白遍存于自然界，細菌、植物、動物以及人類肌體中，是一類對重金屬離子有很強親和力，含豐富的半胱氨酸（約1/3），不含芳香族氨基酸和組氨酸的低分子量蛋白質。金屬硫蛋白含有大量的-SH，能與Hg、Cd、Cu、Ag等重金屬離子結合掩蔽金屬的毒性，對細胞內的金屬離子有重要的解毒作用。目前三十三頁\總數(shù)四十七頁\編于八點生物細胞，在環(huán)境受重金屬污染（Cu、Hg、Cd、Pb、Zn與金屬離子）的情況下，可被誘導合成出大量的金屬硫蛋白，且在一定范圍內成正比，是一項對金屬污染具特異性的指標。用純化的金屬硫蛋白對兔進行免疫，兔抗血清純化后并標記辣根過氧化酶，可實現(xiàn)對食品中重金屬污染的超微量檢測。目前三十四頁\總數(shù)四十七頁\編于八點（8）食物中其它成分檢測ELISA技術同時可以用于食品中其它成分的檢測，如:(1)檢測某些特定的轉移基因表達蛋白，以分析食品是否來自轉基因生物或者含有轉基因成分；（2）食品中營養(yǎng)素的測定，最小檢出限可達0.05μg/g；（3）通過合成不同異黃酮的羥酸半抗原，分析植物中含量很低的雌激素；（4）可用于檢測食品加工過程中的酶（如磷酸丙糖異構酶和轉谷氨酰胺酶）含量的變化等。目前三十五頁\總數(shù)四十七頁\編于八點2聚合酶鏈式反應（PCR）目前三十六頁\總數(shù)四十七頁\編于八點PCR檢測的原理聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）以特定的基因片段為模板，利用人工合成的一對寡聚核苷酸為引物，以四種脫氧核苷酸為底物，在DNA聚合酶的作用下，通過DNA模板的變性，達到基因擴增的目的。PCR是目前轉基因食品檢測較為成熟的方法。目前三十七頁\總數(shù)四十七頁\編于八點我國已應用PCR-酶聯(lián)免疫測定檢測技術，建立了轉基因大豆與玉米中常用外源基因的快速檢測體系，并應用于進出境產品的轉基因檢測實際工作中，結果表明，PCR-酶聯(lián)免疫測定法具有操作簡便、靈敏特異、結果準確的優(yōu)點，可對轉基因大豆、玉米及其它轉基因產品進行定性和定量檢測。目前三十八頁\總數(shù)四十七頁\編于八點PCR檢測的應用對熱處理后的熟肉樣品，要檢測出肉制品中肉的組成比較困難，但經PCR后檢測，牛肉、豬肉、雞肉和火雞肉的最小檢測量可以達到1%～2%，而且肉制品中的抗壞血酸添加劑不影響檢測結果。目前，PCR是區(qū)分雞肉和火雞肉的唯一方法。PCR也用于食品中腐敗菌、病原菌如腸道出血性大腸桿菌、沙門氏菌、弧菌、金黃色葡萄球菌等的檢測。目前三十九頁\總數(shù)四十七頁\編于八點3酶生物傳感器酶傳感器主要利用它對生物體的催化特性，且對特定底物有反應的特異性，把這種特異性與電化學分析的迅速性和簡便性結合起來，從含有多種多樣有機物的生物試樣中，有選擇地把特定物質迅速測定出來。目前四十頁\總數(shù)四十七頁\編于八點酶生物傳感器的簡圖C6H12O6+O2→C6H12O7+H2O2目前四十一頁\總數(shù)四十七頁\編于八點酶傳感器的優(yōu)點它還具有能反復進行，不需要通常進行酶分析時需要的酶和顯示劑，實現(xiàn)無試劑分析，因此，發(fā)展較快，現(xiàn)已有多酶傳感器，可用在生產線上監(jiān)控食品加工流程、發(fā)酵工藝過程及微生物濃度的控制，又可在包裝材料上測知食品是否經過不當溫度的貯存，冷凍時微生物含量及貯存壽命的預警。目前四十二頁\總數(shù)四十