四川農(nóng)業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)答辯用幻燈片

SichuanAgriculturalUniersity齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因的克隆及其序列分析指導(dǎo)老師：姜冬梅學(xué)生姓名：劉永貴所在班級：水教10—2班

SichuanAgriculturalUniersity

目的目錄1

材料與方法2

結(jié)果3結(jié)論4參考文獻5致謝6SichuanAgriculturalUniersity1目的促性腺素受體（GtH-RⅡ）屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，其與促性腺激素（GtHⅡ）結(jié)合后可促進卵母細胞的成熟以及在精子發(fā)生的最后幾個時期起主要作用。魚類中GtHⅡ基因除了在性腺中有豐富的表達外，在非性腺組織中也有少量或微量表達；可是還沒有人對齊口裂腹魚垂體組織中GtH-RⅡ基因進行克隆及序列分析，因此通過完成本次試驗，為進一步研究齊口裂腹魚的繁殖調(diào)控機制提供了一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。SichuanAgriculturalUniersity2材料與方法2.1試驗材料齊口裂腹魚平均體長為30-40cm；平均體重為0.5-1.0kg。采集齊口裂腹魚垂體組織樣品，置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2引物設(shè)計與合成根據(jù)NCBI上斑馬魚GtH-RⅡ的cDNA序列，選取保守區(qū)序列；上游引物為5′CATCCGTCGAGGACACTTTCGGTA3′，下游引物為5′ACACATAGCATCCGCAAATCACGAG3′，委托華大基因科技有限公司進行特異性引物合成。SichuanAgriculturalUniersity2.3方法引物設(shè)計與合成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)PCR擴增PCR產(chǎn)物回收克隆測序序列分析總RNA提取SichuanAgriculturalUniersity3結(jié)果圖1齊口裂腹魚垂體組織總RNA1%瓊脂糖凝膠電泳圖圖2齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因PCR電泳檢測圖3.1總RNA提取結(jié)果3.2RT-PCR產(chǎn)物檢測SichuanAgriculturalUniersity3.3GtH-RⅡ核酸序列比對圖3齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因cDNA部分編碼核酸序列分析齊口裂腹魚斑馬魚鯉魚齊口裂腹魚斑馬魚鯉魚齊口裂腹魚斑馬魚鯉魚齊口裂腹魚斑馬魚鯉魚齊口裂腹魚斑馬魚鯉魚齊口裂腹魚斑馬魚鯉魚齊口裂腹魚斑馬魚鯉魚

GtH-RⅡ基因編碼核酸的測序結(jié)果與Genbank上斑馬魚序列進行相似性分析，相似性達93.0%，與鯉魚的相似性為92.6%。SichuanAgriculturalUniersity3.4氨基酸相似性分析

GtH-RⅡ基因編碼氨基酸序列的測序結(jié)果與Genbank上斑馬魚的序列進行相似性分析，相似性達97%以上。

圖4齊口裂腹魚GtH-RⅡ氨基酸序列及序列分析SichuanAgriculturalUniersity3.5GtH-RⅡ氨基酸組成分析亮氨酸（Leu）含量為最高，達到了16.45%，賴氨酸（Lys）含量最低，只有0.87%；其它具體的氨基酸組成類型及酸值見表1。AminoAcidSingleletterabbreviationsAcidNumberMol%AminoAcidSingleletterabbreviationsAcidNumberMol%AlaA187.79MetM62.60CysC114.76AsnN41.73AspD114.76ProP62.60GluE73.03GlnQ104.33PheF114.76ArgR104.33GlyG156.49SerS166.93HisH62.60ThrT135.63IleI208.66ValV166.93LysK20.87TrpW41.73LeuL3816.45TyrY73.03表1齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因編碼的氨基酸組成圖5齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因編碼的氨基酸組成SichuanAgriculturalUniersity3.6GtH-RⅡ的氨基酸疏水性分析與抗原決定簇預(yù)測GtH-R

Ⅱ基因編碼的氨基酸疏水性中存在4個疏水區(qū)，分別位于第57、90、132和186氨基酸殘基附近;而氨基酸序列中則存在4個抗原決定簇，分別位于第27、34、112和159氨基酸殘基附近。圖6齊口裂腹魚GtH-RⅡ氨基酸的平均疏水性比例圖7齊口裂腹魚GtH-RⅡ蛋白抗原決定簇預(yù)測SichuanAgriculturalUniersity3.7蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測圖8齊口裂腹魚GtH-RⅡ蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測h表示α螺旋；e表示β折疊；c表示無規(guī)則卷曲β折疊占15.24%α螺旋占61.43%無規(guī)則卷曲占23.33%SichuanAgriculturalUniersity3.8蛋白質(zhì)磷酸化位點分析由上圖可知，GtH-RⅡ蛋白中含有4個磷酸化位點，全是Ser（Serine絲氨酸）位點有4個，沒有Thr（threonine蘇氨酸）、Tyr（tyrosine酪氨酸）。圖9齊口裂腹魚LHR蛋白磷酸化位點預(yù)測SichuanAgriculturalUniersity4結(jié)論

此次試驗得到的結(jié)果顯示：獲得的齊口腹裂魚GtH-RⅡ基因的長度為696bp；與斑馬魚的序列相似性較高，表明同源性較近，其基因具有較高的保守性。

對氨基酸和蛋白質(zhì)分析顯示：α螺旋占的比例大，存在4個抗原決定簇和4個疏水區(qū)；說明GtH-RⅡ蛋白柔性好，是油溶性受體蛋白的可能性強。最后得出齊口裂腹魚GtH-RⅡ基因的保守性高，同時也為進一步研究齊口裂腹魚的繁殖調(diào)控機制提供了一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，而具體的調(diào)控機制則有待進一步的研究。SichuanAgriculturalUniersity5參考文獻[1]KraakGVD,SuzukiK,PeterRE,etal.ProPertiesofcommoncarpgonadotroPinIandgonadotroPinⅡ[J].GeneralandComParativeEndocrinology1992,85(2):217-229[2]ObaY,HiraiT,YoshiuraY,etal.Thedualityoffishgonadotropinreceptor：Cloning，functionalcharacterizationofasecondgonaotropinreceptorcDNAexpressedintheovaryandtestisofamagosalmon(oncorhynchusrhodurus)[J].BiochemBiophysResCommun,1999,265(2):366-371.[3]ObaY,HiraiT,YoshiuraY,etal.Cloning,functionalcharac-terization,andexpressionofagonadotropinreceptorcDNAintheovaryandtestisofamagosalmon(Oncorhynchusrhodurus)[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,1999,263(2):584-590.[4]KumarRS,IjiriS,TrantJM.Molecularbiologyofthechannelcatfishgonadotropinreceptors:1.Cloningofafunctionalluteinizinghormonereceptorandpreovulatoryinductionofgeneexpression[J].BiolReprod,2001,64(3):1010-1018.[5]KumarRS,IjiriS,TrantJM.Molecularbiologyofthechannelcatfishgonadotropinreceptors:2.ComplementaryDNAcloning,functionalexpression,andseasonalgeneexpressionofthefollicle-stimulatinghormonereceptor[J].BiolReprod,2001,65(3):710-717.[6]SwansonP,DittmanA.Pituitarygonadotropinsandtheirreceptorsinfish[C]//AdvancesinComparativeEndocrinology.Italy:Bologna,1997.841-856.[7]VischerHF,BogerdJ.CloningandfunctionalcharacterizationofagonadalluteinizinghormonereceptorcomplementaryDNAfromtheAfricancatfish(Clariasgariepinus)[J].BiolReprod,2003,68(1):262-271.[8]BojerdJ,BlomenrohrM,AnderssonE,etal.Discrepancybetweenmolecularstructureandligandselectivityofatesticularfollicle-stimulatinghormonereceptoroftheAfricancatfish(ClariasgariePinus)[J].BiolReprod,2001,64(6):1633-1643.[9]RochaA,GómezA,ZanuyS,etal.Molecularcharacterizationoftwoseabassgonadotropinreceptors:cDNAcloning,expressiona-nalysis,andfunctionalactivity[J].MolecularandCellularEndo-crinology,2007,272(1-2):63-76.[10]MittelholzerC,AnderssonE,TarangerGL,etal.MolecularcharacterizationandquantifcationofthegonadotropinreceptorsFSH-RandLH-RfromAtlanticcod(Gadusmorhua)[J].Gener-alandComparativeEndocrinology,2009,160(1):47-58.[11]SchulzRW,VischerHF,CavacoJEB,etal.Gonadotropins,theirreceptors,andtheregulationoftesticularfunctionsinfish[J].ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartB,2001,129(2):407-417.[12]AscoliM,FanelliF,SegaloffDL.Thelutropin/choriogonado-tropinreceptor,a2002perspective[J].EndocrRev,2002,23(2):141-174.[13]ThemmenAPN,HuhtaniemiIT.Mutationsofgonadotropinsandgonadotropinreceptors:elucidatingthephysiologyandpatho-physiologyofpituitary-gonadalfunction[J].EndocrRev,2000,21(5):551-583.[14]VassartG,PardoL,CostagliolaS.Amoleculardissectionoftheglycoproteinhormonereceptors[J].TrendsBiochemSci,2004,29(3):119-126.[15]劉瓊,李建中,周毅,等.魚類促性腺激素受體研究進展[J].生命科學(xué)研究，2010，14（3）：263-267.[16]Ma