細(xì)胞產(chǎn)物分析技術(shù)質(zhì)譜分析

關(guān)于細(xì)胞產(chǎn)物分析技術(shù)質(zhì)譜分析第1頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月§概述§質(zhì)譜儀的工作原理§質(zhì)譜儀種類§色譜－質(zhì)譜聯(lián)用

GC-MS聯(lián)用LC-MS聯(lián)用§應(yīng)用示例第2頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月氣體分子或固體、液體的蒸氣受到一定能量的電子流轟擊或強(qiáng)電場作用，丟失價(jià)電子生成分子離子；同時(shí)，化學(xué)鍵也發(fā)生某些有規(guī)律裂解，生成各種碎片離子。這些帶正電荷的離子在電場和磁場的作用下，按質(zhì)荷比（即質(zhì)量與電荷比值m/z）的大小分開，排列成譜，記錄下來即為質(zhì)譜（MassSpectroscopy）。概述——基本概念第3頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月第4頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——特點(diǎn)質(zhì)譜是定性鑒定與研究分子結(jié)構(gòu)的有效方法。

靈敏度高：絕對靈敏度可達(dá)5pg（pg為10-12g）

樣品用量少：微克級

分析速度快：掃描1-1000u僅需1/1000秒

測定對象廣：氣體、液體、室溫下具有10-7Pa蒸汽

壓的固體第5頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——用途

求準(zhǔn)確的分子量化學(xué)式的確定推測未知物的結(jié)構(gòu)

鑒定同分異構(gòu)體測定分子中Cl、Br等的原子數(shù)……第6頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——質(zhì)譜的發(fā)展史1912年世界上第一臺現(xiàn)代意義質(zhì)譜儀在英國劍橋Cavendish實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)1918年世界上第一臺實(shí)際意義質(zhì)譜儀在美國芝加哥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)(扇型磁場MS)1943年世界上第一臺商業(yè)質(zhì)譜儀1953年四極桿質(zhì)量分析器質(zhì)譜儀1955年飛行時(shí)間質(zhì)量分析器質(zhì)譜儀60’s開發(fā)GC/MS60’s-70’s大氣壓電離(APcI)源被發(fā)現(xiàn)(但并未被廣泛應(yīng)用)70’s-80’s開始廣泛研究LC/MS1982年離子束LC/MS接口出現(xiàn)1984年第一臺電噴霧MS儀宣告誕生1988年電噴霧離子源MS首次應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分析......第7頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

JosephJ.Thomson1906年諾貝爾物理獎(jiǎng)電荷在氣體中的運(yùn)動(dòng)FrancisWilliamAston1922年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)同位素

WolfgangPaul1989年諾貝爾物理獎(jiǎng)離子阱技術(shù)質(zhì)譜的發(fā)展史HansG.Dehmelt1989年諾貝爾物理獎(jiǎng)離子阱技術(shù)年KoichiTanaka2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)基質(zhì)輔助激光解吸電離方法JohnBennetFenn2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)電噴霧離子化第8頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月MALDI-TOF-TOFMS

MALDI-TOFMSnanoESIQ-TOFMS4000QTRAPMS串聯(lián)四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀基質(zhì)輔助激光解吸串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀納升液相-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀第9頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月分子離子MolecularIon

試樣分子失去或得到一個(gè)電子而形成的離子。它在正離子場合下表示為M?＋。它的質(zhì)荷比即表明試樣分子所對應(yīng)的分子量數(shù)值。母離子

ParentIon產(chǎn)生某一碎片的前體離子，母離子不一定是分子離子。子離子

DaughterIon由母子離子裂解后形成的離子。常見術(shù)語:第10頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月常見術(shù)語:質(zhì)荷比:

離子質(zhì)量(以相對原子量單位計(jì))與它所帶電荷(以電子電量為單位計(jì))的比值,寫作m/Z.峰:

質(zhì)譜圖中的離子信號通常稱為離子峰或簡稱峰.離子豐度:

檢測器檢測到的離子信號強(qiáng)度.第11頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)譜儀的工作原理即：

由分子結(jié)構(gòu)與裂解方式的經(jīng)驗(yàn)規(guī)律,根據(jù)分子離子和各種碎片離子的質(zhì)荷比及其相對豐度,就可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。有機(jī)分子電子轟擊質(zhì)譜裂解碎片離子分子離子(-e)(M)(M)+分離、收集、記錄第12頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月分子離子化，它通過在離子源中進(jìn)行電子電離、快速原子/離子轟擊、基體輔助激光解吸或電噴霧來實(shí)現(xiàn)；帶電分子的離子及其碎片必須根據(jù)其質(zhì)荷比來得到分離，這往往在質(zhì)量分析器中進(jìn)行；最后，分離的帶電荷的碎片必須通過檢測器檢測。真空系統(tǒng)第13頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月直接進(jìn)樣法（靜態(tài)法）：對純的化合物來說，一般為氣體或揮發(fā)性液體，可直接進(jìn)樣到離子源室，而不需要專用設(shè)備或器件，這類似于氣相色譜中的樣品進(jìn)樣。直接插入探針法：對于揮發(fā)性很小的固體樣品，需將樣品放在不銹鋼桿或探針頂端的小杯內(nèi)，將探針通過樣品加入口放進(jìn)離子源中，然后加熱離子源直至固體揮發(fā)。動(dòng)態(tài)平衡法（色譜進(jìn)樣）：對一些組分較復(fù)雜的混合物時(shí)，需將樣品分離成一個(gè)個(gè)單一組分，再進(jìn)入質(zhì)譜儀。最典型的就是氣相或液相色譜通過接口與質(zhì)譜連接。進(jìn)樣系統(tǒng)第14頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月在離子源中樣品被電離成離子，不同性質(zhì)的樣品可能需要不同的電離方式。電子轟擊電離（electronimpact,EI)電子轟擊電離使用具有一定能量的電子直接作用于樣品分子，使其電離。用鎢或錸制作的燈絲在高真空中發(fā)射出電子。燈絲與電離盒之間的電壓稱為電離電壓。對有機(jī)化合物通常選用70eV的電壓。離子源第15頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月化學(xué)電離（Chemicalionization,CI)化學(xué)電離:是將樣品氣體和反應(yīng)氣體分子混合（其中樣品含量約0.1％），進(jìn)入電離室后，首先用電子轟擊方式使反應(yīng)氣體電離，然后反應(yīng)氣體與樣品氣體進(jìn)行離子-分子反應(yīng)而使樣品氣體電離，因此樣品的離子是由離子-分子反應(yīng)產(chǎn)生的。這樣產(chǎn)生的離子能量較小，故碎片較少。對于不穩(wěn)定的有機(jī)化合物，可得到較強(qiáng)的分子離子峰。第16頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月大氣壓化學(xué)電離（atmosphericpressurechemicalionization,APCI)在大氣壓下，化學(xué)電離反應(yīng)的速率更大，電離效率應(yīng)更高。主要困難是將大氣壓力下產(chǎn)生的離子轉(zhuǎn)移到處于高真空（<10-6Torr)狀態(tài)的質(zhì)量分析器中?，F(xiàn)在常用的是電暈放電大氣壓電離。第17頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月快原子轟擊（Fastatombombardment,FAB)用加速的中性原子（快原子）撞擊以甘油（底物）調(diào)和后涂在金屬表面的有機(jī)化合物（“靶面”），導(dǎo)致這些有機(jī)化合物電離的方法稱之為快原子轟擊（FAB）。由于快原子轟擊是一種軟電離技術(shù)，被分析樣品不須經(jīng)過氣化而直接電離，所以，快原子轟擊質(zhì)譜法常用于分析極性強(qiáng)、不易氣化和熱穩(wěn)定性差的樣品。第18頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月電噴霧電離（Electrosprayionization,ESI)原理：不銹鋼毛細(xì)管被加以3-5kV的正電壓，與相距約1cm接地的反電極形成強(qiáng)靜電場。被分析的樣品溶液從毛細(xì)管流出時(shí)在電場作用下形成高度荷電的霧狀小液滴；在向質(zhì)量分析器移動(dòng)的過程中，液滴因溶劑的揮發(fā)逐漸縮小，其表面上的電荷密度不斷增大。當(dāng)電荷之間的排斥力足以克服表面張力時(shí)，液滴發(fā)生裂分；經(jīng)過這樣反復(fù)的溶劑揮發(fā)－液滴裂分過程，最后產(chǎn)生單個(gè)多電荷離子。電噴霧通常要選擇合適的溶劑。除了考慮對樣品的溶解能力外，溶劑的極性也需考慮。一般來說，極性溶劑（如甲醇、乙腈、丙酮等）更適合于電噴霧。第19頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月電噴霧（ESI)離子化過程電噴霧離子化可分為三個(gè)過程:1、形成帶電小液滴2、溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂3、最終形成氣相離子第20頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器的作用是將離子源中形成的離子按質(zhì)荷比的大小不同分開，質(zhì)量分析器可分為靜態(tài)分析器和動(dòng)態(tài)分析器兩類。靜態(tài)分析器采用穩(wěn)定不變的電磁場（電磁場隨時(shí)間改變，只是為了記錄質(zhì)譜而不是分離原理所要求的），并且按照空間位置把不同質(zhì)量（m/e）的離子分開。屬于這一類的儀器有單聚焦磁場分析器和雙聚焦磁場分析器。動(dòng)態(tài)分析器采用變化的電磁場，按照時(shí)間或空間來區(qū)分質(zhì)量不同的離子。屬于這一類的儀器有飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、四極濾質(zhì)器等。第21頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月四極桿質(zhì)量分析器由四根精密加工的電極桿以及分別施加于x、y方向兩組高壓高頻射頻組成的電場分析器。高壓高頻信號提供了離子在分析器中運(yùn)動(dòng)的輔助能量，只有符合一定數(shù)學(xué)條件的離子才能夠不被無限制的加速，從而安全的通過四極桿分析器。第22頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月離子阱離子阱質(zhì)譜與四極桿質(zhì)譜同樣利用了離子在射頻電場的運(yùn)動(dòng)特性。用高頻交流電把離子限制在離子阱里，然后用離子的特征電壓分別將其推出離子阱，到檢測器檢測。離子阱質(zhì)量分析器具有結(jié)構(gòu)簡單和對真空度要求低等特點(diǎn)，因而成為制造小型質(zhì)譜儀的首選.第23頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月飛行時(shí)間質(zhì)譜這種質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器是一個(gè)離子漂移管，由離子源產(chǎn)生的離子加速后進(jìn)入無場漂移管，并以恒定速度飛向離子接收器。離子質(zhì)量越大，到達(dá)接收器所用時(shí)間越長，離子質(zhì)量越小，到達(dá)接收器所用時(shí)間越短，根據(jù)這一原理，可以把不同質(zhì)量的離子按m/z值大小進(jìn)行分離。第24頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月第25頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月真空系統(tǒng)質(zhì)譜儀器中凡有樣品分子和離子的地方必須抽成真空狀態(tài)，即質(zhì)譜儀的離子源、質(zhì)量分析器及檢測系統(tǒng)都必須處于真空狀態(tài)下工作（一般為1.333×10-4～1.333×10-6Pa

）。質(zhì)譜儀的真空系統(tǒng)要求殘余氣體中不能留有對測定不利的氣體成分，否則：空氣中的氧會燒壞離子源的燈絲；會引起額外的離子－分子反應(yīng)，使質(zhì)譜復(fù)雜化;且干擾離子源中電子束的正常調(diào)節(jié)，影響儀器的分辨率；真空度低會使本底增高，干擾質(zhì)譜圖。第26頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)譜儀種類有機(jī)質(zhì)譜儀：

①

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）在這類儀器中，由于質(zhì)譜儀工作原理不同，又有氣相色譜-四極質(zhì)譜儀，氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，氣相色譜-離子阱質(zhì)譜儀等。

②液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）。同樣，有液相色譜-四極質(zhì)譜儀，液相色譜-離子阱質(zhì)譜儀，液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，以及各種各樣的液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

③

其他有機(jī)質(zhì)譜儀基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOFMS）；傅立葉變換質(zhì)譜儀（FT-MS）。第27頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)譜儀種類無機(jī)質(zhì)譜儀包括：①火花源雙聚焦質(zhì)譜儀。②感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）。③二次離子質(zhì)譜儀（SIMS）。同位素質(zhì)譜儀氣體分析質(zhì)譜儀主要有呼氣質(zhì)譜儀，氦質(zhì)譜檢漏儀等。除上述分類外，還可以根據(jù)質(zhì)譜儀所用質(zhì)量分析器的不同，把質(zhì)譜儀分為雙聚焦質(zhì)譜儀、四極桿質(zhì)譜儀、飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、離子阱質(zhì)譜儀、傅立葉變換質(zhì)譜儀等。第28頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)譜：純物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析色譜：化合物分離色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：共同優(yōu)點(diǎn)GC-MS；LC-MS；CZE-MS困難點(diǎn)：載氣(或流動(dòng)液)的分離；出峰時(shí)間監(jiān)測；儀器小型化；關(guān)鍵點(diǎn)：接口技術(shù)(分子分離器)色譜－質(zhì)譜聯(lián)用第29頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用第30頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月要使氣相色譜和質(zhì)譜儀器聯(lián)用，首先要解決的問題是氣壓問題。色譜柱出口壓通常是常壓，而質(zhì)譜儀在正常工作壓力是高真空，故二者無法相接。必須采用一個(gè)連接器，用來除去載氣，以降低氣相色譜流出物的氣壓并富集試樣，以達(dá)到質(zhì)譜儀的工作要求。如果色譜儀使用填充柱，必須經(jīng)過一種接口裝置——分子分離器，將色譜載氣去除，使樣品氣進(jìn)入質(zhì)譜儀；如果色譜儀使用毛細(xì)管柱，則可以將毛細(xì)管直接插入質(zhì)譜儀離子源，因?yàn)槊?xì)管載氣流量比填充柱小很多，不會破壞質(zhì)譜儀真空。第31頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月在GC/MS分析中，常用的離子源有電子轟擊離子源（EI），化學(xué)電離源（CI），EI/±CI復(fù)合源，場致電離源（FI），大氣壓化學(xué)電離源（APCI）等。第32頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月儀器結(jié)構(gòu)色譜-四極桿質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)示意圖第33頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月LC-MS液質(zhì)聯(lián)用大多數(shù)高效液相色譜的組分是非揮發(fā)性的或熱分解性的，這使得由液相轉(zhuǎn)化為氣相的任務(wù)更具有挑戰(zhàn)性，尤其是要保證組分的完整性。最常用的三種連接方式是熱噴霧(TSP）法、電噴霧（ESI）法和大氣壓電離（APCI）法。第34頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月

液質(zhì)聯(lián)用流程圖第35頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月LC-MS分析條件的選擇電離源的選擇ESI和APCI在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出它們各自的優(yōu)勢和弱點(diǎn)。ESI適合于中等極性到強(qiáng)極性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以獲得多個(gè)質(zhì)子的大分子（蛋白質(zhì)）。只要有相對強(qiáng)的極性，ESI對小分子的分析常?？梢缘玫綕M意的結(jié)果。APCI不適合多電荷的大分子分析，它的優(yōu)勢在于非極性或中等極性的小分子的分析。第36頁，課件共42頁，創(chuàng)作于2023年2月①電離方式

ESI采用離子蒸發(fā)方式使樣品分子電離，而APCI電離是放電探針促使溶劑和其它反應(yīng)物電離、碰撞及電荷轉(zhuǎn)移等方式形成了反應(yīng)氣等離子區(qū)，樣品分子通過等離子區(qū)時(shí)，發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移。②樣品流速

APCI源允許的流量相對較大，0.2-2mL/min，而ESI源允許流量相對較小，最大只能為1.0mL/min。③斷裂程度

APCI源的探頭處于高溫，可使熱不穩(wěn)定的化合物分解，產(chǎn)生碎片；ESI源探頭處于常溫，常生成分子離子峰，不易產(chǎn)生碎片。④靈敏度都很高。ESI有利于分析生物大分子及其他分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性小的化合物。⑤多電荷

APCI源不能生成一系列多電荷離子，所以不適合分析生物大分子。而ESI源特別適合于蛋白質(zhì)、多肽類