紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

關(guān)于紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量第1頁(yè)，課件共15頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理；熟練掌握紫外分光光度計(jì)測(cè)定原理及使用方法。第2頁(yè)，課件共15頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、實(shí)驗(yàn)原理

由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，最大吸收峰在280nm波長(zhǎng)處。在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光密度OD280nm與其濃度呈正比關(guān)系，可作定量測(cè)定。第3頁(yè)，課件共15頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑

1．試驗(yàn)材料：待測(cè)的蛋白質(zhì)溶液。2．

主要儀器：（1）紫外分光光度計(jì)，（2）試管與試管架，（3）刻度吸量管3．試劑：（1）標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液：準(zhǔn)確稱取經(jīng)凱氏定氮法校正的結(jié)晶牛血清蛋白，配制成濃度為1mg/mL的溶液。（2）待測(cè)蛋白質(zhì)溶液：濃度為1mg/mL左右的溶液第4頁(yè)，課件共15頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、操作步驟1．標(biāo)準(zhǔn)曲線制作按下表分別向每支試管內(nèi)加入各種試劑，混勻。以光程為1cm的石英比色杯，在280nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。第5頁(yè)，課件共15頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2．樣品測(cè)定取待測(cè)蛋白質(zhì)溶液1mL，加入蒸餾水3mL，混勻，按上述方法測(cè)定280nm的光密度，并從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查出待測(cè)蛋白質(zhì)溶液的濃度。第6頁(yè)，課件共15頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月五、附注1．在測(cè)定工作中，可以利用280nm及260nm的光密度值求出蛋白質(zhì)的濃度：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.45OD280nm―0.74OD260nm上式中的OD280nm是蛋白質(zhì)溶液在280nm下測(cè)得的光密度，OD260nm是蛋白質(zhì)溶液在260nm下測(cè)得的光密度。第7頁(yè)，課件共15頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2．對(duì)于有核酸存在時(shí)所造成的誤差，可將待測(cè)的蛋白質(zhì)溶液稀釋至光密度在0.2~2.0之間，選用光程為1cm的石英比色杯，在280nm及260nm處分別測(cè)出光密度OD280nm/OD260nm的比值，從下表中查出校正因子“F”值，同時(shí)可查出該樣品內(nèi)混雜的核酸的百分含量，將F值代入下述公式，即可計(jì)算出該溶液的蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=F×OD280nm×D式中：OD280nm為被測(cè)溶液在280nm紫外波長(zhǎng)下的光密度，D為溶液的稀釋倍數(shù)。第8頁(yè)，課件共15頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月OD280nm/OD260nm校正因子核酸%OD280nm/OD260nm校正因子核酸%1.751.1160.000.8460.6565.501.631.0810.250.8220.6326.001.521.0540.500.8040.6076.501.401.0230.750.7840.5857.001.360.9941.000.7670.5657.51.300.9701.250.7530.5458.001.250.9441.500.7300.5089.001.160.8992.000.7050.47810.001.090.8522.500.6710.42212.001.030.8143.000.6440.37714.000.9790.7763.500.6150.32217.000.9390.7434.000.5950.27820.000.8740.6825.00

注：通常純蛋白質(zhì)的OD280nm/OD260nm

約為1.8，而純核酸的比值約為0.5。第9頁(yè)，課件共15頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六、思考題

1．紫外吸收法與Folin-酚比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量相比，有何缺點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)？2．若樣品中含有核酸類雜質(zhì)，應(yīng)如何校正？第10頁(yè)，課件共15頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月參考答案1．蛋白質(zhì)測(cè)定的Folin-酚比色法（即Lowry法）的定量范圍為5～100μg蛋白質(zhì)，靈敏度高；但操作要費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間，且Folin試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用；不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強(qiáng)度也稍有不同。紫外吸收法測(cè)蛋白質(zhì)含量迅速、簡(jiǎn)便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。因此，已在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛采用，尤其在柱層析分離純化中，常用280nm進(jìn)行紫外檢測(cè)，來(lái)判斷蛋白質(zhì)吸附或洗脫情況。第11頁(yè)，課件共15頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月但該法的缺點(diǎn)是：（1）對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。（2）若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大干擾。例如，在制備酶的過(guò)程中，層析柱的流出液中有時(shí)混雜有核酸，應(yīng)予以校正第12頁(yè)，課件共15頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2．當(dāng)樣品中含有核酸類雜質(zhì)，可以根據(jù)核酸在260nm波長(zhǎng)處有最強(qiáng)的紫外光吸收，而蛋白質(zhì)在280nm處有最大的紫外光吸收的性質(zhì)，通過(guò)計(jì)算可以適當(dāng)校正核酸對(duì)于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的干擾作用。但是，因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過(guò)校正，測(cè)定結(jié)果還存在著一定的誤差第13頁(yè)，課件共15頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月表1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作管號(hào)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（mL）蒸餾水（mL）蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）OD280nm1040

20.53.50.125

31.03.00.25

41.52.50.375