生物工程制藥之生物轉(zhuǎn)化

關(guān)于生物工程制藥之生物轉(zhuǎn)化第1頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

酶作為一種生物催化劑是神奇的，它的參與使無(wú)法完成的有機(jī)合成反應(yīng)成為可能。立體和選擇性催化是其精華所在。生物轉(zhuǎn)化第2頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化

生物轉(zhuǎn)化(biotransformation)是利用微生物及其細(xì)胞器、植物離體細(xì)胞或器官、動(dòng)物細(xì)胞以及游離酶對(duì)外源性化合物(exogenoussubstrate)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的生化反應(yīng)。微生物轉(zhuǎn)化可用完整的微生物細(xì)胞或從微生物中提取的酶作為生物催化劑。

FDA將這類(lèi)產(chǎn)品列入天然產(chǎn)品,這為生物轉(zhuǎn)化及天然發(fā)酵產(chǎn)物的市場(chǎng)化提供了一個(gè)很好的軟環(huán)境。第3頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化

生物轉(zhuǎn)化是生化工程、酶工程、基因工程等交叉的技術(shù)，與有機(jī)化學(xué)合成緊密地結(jié)合在一起第4頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化

對(duì)于復(fù)雜結(jié)構(gòu)的天然活性成分來(lái)說(shuō),利用化學(xué)合成來(lái)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾存在著得率低,反應(yīng)專(zhuān)一性差、副產(chǎn)品多等缺點(diǎn),生物轉(zhuǎn)化技術(shù)卻可彌補(bǔ)化學(xué)合成的不足。

至今生物轉(zhuǎn)化已涉及羥基化、環(huán)氧化、脫氫、氫化等氧化還原反應(yīng)、水解、水合、酯化、酯轉(zhuǎn)移、酰化、脫羧、脫水、異構(gòu)化等各類(lèi)化學(xué)反應(yīng)。生物轉(zhuǎn)化技術(shù)最關(guān)鍵最困難之處在于獲得轉(zhuǎn)化反應(yīng)所需的菌株或酶。一旦獲得了適當(dāng)?shù)纳锎呋瘎?生物轉(zhuǎn)化將不成問(wèn)題。第5頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.1生物轉(zhuǎn)化在制備D-氨基酸在自然界中D-氨基酸相對(duì)稀少,被冠以“非天然”氨基酸之稱(chēng),但D-氨基酸在醫(yī)藥、農(nóng)藥和食品等的組成中起著重要的作用,特別是它們已被用于合成β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和生理活性肽。第6頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.1生物轉(zhuǎn)化在制備D-氨基酸眾所周知自然界中存在20種基本氨基酸,除甘氨酸外都有2種互成鏡像的對(duì)映體D型和L型,歷來(lái)認(rèn)為生命物質(zhì)只存在L型氨基酸,并曾將L型冠以“天然”,而D型就成了“非天然”。與L-氨基酸相比,D-氨基酸種類(lèi)少,只占自然界已發(fā)現(xiàn)的300多種氨基酸的10%左右,但其價(jià)格十分昂貴。第7頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.1生物轉(zhuǎn)化在制備D-氨基酸

隨著分析方法的發(fā)展,人們相繼在海洋動(dòng)物、陸生動(dòng)物、脊椎和無(wú)脊椎動(dòng)物、種子植物和人體中發(fā)現(xiàn)了各種D-氨基酸之后,D-氨基酸才引起人們的高度重視,并意識(shí)到它們?cè)卺t(yī)藥、農(nóng)藥和食品等的重要組成中起著重要作用。第8頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.1生物轉(zhuǎn)化在制備D-氨基酸人體的一些疾病與體內(nèi)D-氨基酸的含量有關(guān),諸如白內(nèi)障晶體渾濁、早老年癡呆癥以及某些腎臟疾病的病人,其體內(nèi)某些組織中D-氨基酸含量均高于正常人,D-氨基酸還會(huì)阻斷一些重要生物物質(zhì)的合成,從而抑制了動(dòng)物的生長(zhǎng)。D-氨基酸對(duì)研究某些疾病和衰老機(jī)制十分重要,此外D-氨基酸已被用于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和生理活性肽的生物合成。第9頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.1生物轉(zhuǎn)化在制備D-氨基酸5.1.1生物轉(zhuǎn)化法制備D-氨基酸一般來(lái)講D-氨基酸要靠合成制得,但各種合成法均有缺陷，有的合成步驟較長(zhǎng),有的手性助劑價(jià)格昂貴,有的光學(xué)純度達(dá)不到要求等。

第10頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.1.1.1由DL-丙氨酸生產(chǎn)制備D-丙氨酸生物催化劑:麥芽假絲酵母。原理:麥芽假絲酵母能不對(duì)稱(chēng)降解DL-丙氨酸,降解L-丙氨酸的速度比降解D-丙氨酸的速度快10倍,從而除去L-丙氨酸,積累D-丙氨酸。工藝:加入200g/LDL-丙氨酸作為底物,麥芽假絲酵母在30℃、pH6.0、通風(fēng)量1.0vvm和1200r/min的最適條件下,經(jīng)40h后L-丙氨酸完全降解。結(jié)果:經(jīng)分離后,最終得99.0%的化學(xué)純和99.9%光學(xué)純度的D-丙氨酸。第11頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.1.1.2惡臭假單孢菌產(chǎn)生的二氫嘧啶酶原理:二氫嘧啶酶（D-海因酶）,只催化D-型海因、嘧啶水解,生成N-氨甲酰-D-氨基酸,對(duì)L型海因、嘧啶不被水解。工藝:用醛為原料,經(jīng)Bucher反應(yīng)合成DL-5-取代乙內(nèi)酰脲,然后用惡臭假單孢菌的二氫嘧啶酶催化選擇性水解為N-氨甲酰-D-氨基酸,再經(jīng)化學(xué)或酶法脫氨甲?；肈-氨基酸。結(jié)果:由DL-5-取代乙內(nèi)酰脲生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸,收率達(dá)92%。第12頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化第13頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.1.2酶法拆分原理:外消旋氨基酸先生成其衍生物如外消旋酯、酰胺,然后被酶或微生物選擇性水解成旋光純氨基酸,再通過(guò)常規(guī)化學(xué)物理方法從反應(yīng)混合物中分離。酶法拆分常用的酶有脂肪酶、酯酶和蛋白酶等水解酶。缺點(diǎn):1)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的L-氨基酸積累到一定程度會(huì)抑制進(jìn)一步拆分,因而降低了摩爾分率;2)底物在發(fā)酵液中溶解度低,限制了生產(chǎn)能力;3)酶的穩(wěn)定性差;4)有些酶要求反應(yīng)底物濃度極稀,反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),不利于大規(guī)模生產(chǎn)第14頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.1.2酶法拆分優(yōu)化:固定化生物催化劑因其能反復(fù)利用,使用壽命較游離酶有明顯提高,可極大地降低成本,在氨基酸拆分中得到了成功的應(yīng)用。第15頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.1.2酶法拆分手性流動(dòng)相拆分

普通色譜固定相也用于DL-氨基酸的色譜拆分,但需要在流動(dòng)相中加入手性絡(luò)合物修飾劑。手性流動(dòng)相拆分法中手性絡(luò)合物的配體多為L(zhǎng)-氨基酸及其衍生物,手性絡(luò)合物的金屬離子多為Cu2+或Ni2+。流動(dòng)相中手性絡(luò)合物的濃度一般以1～10mmol/L為宜,流動(dòng)相pH為5左右。第16頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.2生物轉(zhuǎn)化合成抗生素5.2.1氨芐青霉素的生產(chǎn)酶法轉(zhuǎn)化氨芐青霉素由三步反應(yīng)組成1）酶轉(zhuǎn)化青霉素為6-氨基青霉烷酸（6-APA）2）酶轉(zhuǎn)化氨芐青霉素的側(cè)鏈（如D-苯甘氨酸、D-對(duì)羥基苯甘氨酸）3）酶法連接側(cè)鏈到青霉素母核6-APA第17頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.2.1氨芐青霉素的生產(chǎn)第18頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.2.1氨芐青霉素的生產(chǎn)第一步將青霉素G酰胺酶固定化，載體為環(huán)氧丙烯珠狀聚合體。（經(jīng)過(guò)500次循環(huán)仍保持90%以上的酶活）第19頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.2.1氨芐青霉素的生產(chǎn)第二步側(cè)鏈的制備1）合成DL-苯基甘氨酰胺2）采用微生物胺肽酶選擇性催化DL-苯基甘氨酰胺鍵斷裂，拆分產(chǎn)生L-苯甘氨酸和D-苯基甘氨酰胺。3）用苯甲醛形成不溶性西夫堿將D-苯基甘氨酰胺從反應(yīng)混合物中分離4）用酸水解后獲得沒(méi)有外消旋的D-苯甘氨酸第20頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.2.1氨芐青霉素的生產(chǎn)第三步青霉素G?；笇?cè)鏈連接到母核第21頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.2生物轉(zhuǎn)化合成抗生素5.2.2阿莫西林的生產(chǎn)第22頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在天然藥物研究開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用

5.3.1青蒿素的微生物轉(zhuǎn)化修飾第23頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化青蒿素是1971年從藥用植物黃花蒿(ArtermisiaannuaL.)中分到的一個(gè)具有過(guò)氧橋的倍半萜類(lèi)化合物,具有快速、高效、低毒的抗瘧活性,目前,全球共有25億人口處于瘧疾的威脅之中。青蒿素及其衍生物蒿甲醚、雙氫青蒿素及青蒿酯鈉在我國(guó)已廣泛應(yīng)用于臨床。同時(shí),世界衛(wèi)生組織正在開(kāi)發(fā)研究蒿乙醚。第24頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化

許多科研工作者試圖通過(guò)結(jié)構(gòu)改造,提高藥物療效,以提高青蒿素的資源利用率。迄今為止已制備了數(shù)百個(gè)青蒿素的衍生物,并篩選出雙氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿虎酯及青蒿酯鈉等幾個(gè)高效抗瘧衍生物，但是由于青蒿素的有效活性基團(tuán)過(guò)氧橋的不穩(wěn)定性,使得對(duì)青蒿素結(jié)構(gòu)改造無(wú)法在酮基以外的部位進(jìn)行,目前可用的有機(jī)化學(xué)改造方法主要停留在對(duì)酮基的還原。第25頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化

從發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了16個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物并鑒定了其中14個(gè)結(jié)構(gòu),其中10個(gè)為新化合物。這14個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中除一個(gè)為羰基化產(chǎn)物外,其余13個(gè)都是羥基化產(chǎn)物,極性都大于底物。這些化合物都是用化學(xué)方法無(wú)法制備的。

第26頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在天然藥物研究開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用其中9個(gè)新化合物為:9α-羥基青蒿素,9β-羥基青蒿素,青蒿酮-9,9α-羥基雙氫青蒿素,9α-羥基-α-雙羥基青蒿素,2α-羥基雙氫青蒿素,2α-羥基-α-雙氫青蒿素,9α、9β-二羥基去氧蒿甲醚,2α、9β-二羥基蒿甲醚,2α、9α-二羥基蒿甲醚。第27頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.2稀有人參皂甙的微生物轉(zhuǎn)化以人參皂甙為原料,從野山參生長(zhǎng)的土壤中分離篩選菌種,利用這些菌種對(duì)總皂甙進(jìn)行了發(fā)酵,制備了具有抗腫瘤、抗血栓等強(qiáng)生物活性的稀有人參皂甙。第28頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.2稀有人參皂甙的微生物轉(zhuǎn)化

人參皂甙(約為30余種)按甙元結(jié)構(gòu)分為三類(lèi):齊墩果酸類(lèi)、原人參二醇及原人參三醇類(lèi)。人參皂甙Rh1、Rh2、Rh3、Rg3

、Rg5雖然含量?jī)H為十萬(wàn)分之一,但生理活性卻很高,如Rg3、Rg5具有很好的抗癌、抗血栓和軟化血管的療效,臨床實(shí)驗(yàn)證明Rg3對(duì)多種實(shí)體瘤的抑制率可達(dá)60%,對(duì)肺腫瘤的抑制率為70%～80%,抑制肺癌小細(xì)胞(OC10)胰腺癌細(xì)胞(PSN-1)的生長(zhǎng);人參皂甙Rh2能抑制人卵巢癌、morris肝癌、人子宮頸癌、B16黑色素瘤、HELA細(xì)胞的增殖,抑制人早幼粒白血病HL60瘤株,使培養(yǎng)的癌細(xì)胞表型逆轉(zhuǎn)等。利用發(fā)酵轉(zhuǎn)化的技術(shù)使Rg3的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了3%～5%、Rh2的轉(zhuǎn)化率也達(dá)到了1%～2%。第29頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.2稀有人參皂甙的微生物轉(zhuǎn)化GinsenosideRg3第30頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.3微生物轉(zhuǎn)化喜樹(shù)堿衍生物同喜樹(shù)堿相比,10-羥基喜樹(shù)堿以療效好,毒性低較為常用,但含量?jī)H為萬(wàn)分之幾。在喜樹(shù)的總生物堿中喜樹(shù)堿為主要成分,10-羥基喜樹(shù)堿僅占十萬(wàn)分之二,依靠從天然資源中提取則費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、浪費(fèi)資源。研究發(fā)現(xiàn)利用曲霉等多種微生物能將喜樹(shù)堿定向轉(zhuǎn)化成10-羥基喜樹(shù)堿,為解決資源問(wèn)題闖出了新路。第31頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.3微生物轉(zhuǎn)化喜樹(shù)堿衍生物10

-hydroxycamptothecineR=OH第32頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.4生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在甾體藥物研究開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用微生物對(duì)類(lèi)固醇和固醇底物的氧化還原反應(yīng)，使我們對(duì)生物轉(zhuǎn)化的區(qū)域選擇性和立體選擇性留下了特別深刻的印象，并證明酶具有促進(jìn)碳?xì)浠衔镂椿罨行膮^(qū)域反應(yīng)的能力。第33頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.4.1類(lèi)固醇母核碳架結(jié)構(gòu)第34頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.4生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在甾體藥物研究開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用5.4.1類(lèi)固醇母核碳架結(jié)構(gòu)由A、B、C、D四個(gè)環(huán)組成，并不在一個(gè)平面上，其生物活性決定于附著在系統(tǒng)上的基團(tuán)定位。

C6基團(tuán)凸出類(lèi)固醇平面之上的構(gòu)型命名為β構(gòu)型，它們和環(huán)系統(tǒng)的聯(lián)系用實(shí)線(xiàn)表示；那些投影在平面之下的構(gòu)型稱(chēng)為α構(gòu)型，它們和環(huán)的連接用點(diǎn)線(xiàn)表示。第35頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.4.2甾醇類(lèi)或類(lèi)固醇化合物的生物轉(zhuǎn)化發(fā)展甾醇類(lèi)或類(lèi)固醇化合物（steroids）是廣泛分布于自然界的物質(zhì)，作為激素可以調(diào)節(jié)動(dòng)植物的生命代謝，同時(shí)也有助于脂類(lèi)的消化和吸收以及抗炎、抗毒素等作用。它們以環(huán)戊烷多氫菲（cyclopentanoperhydrophenanthrene）為基本結(jié)構(gòu)，其中一大類(lèi)稱(chēng)為甾醇類(lèi)（sterols，或固醇類(lèi)）化合物，如豆甾醇（stigmasterol，見(jiàn)圖1）和麥甾醇（sitosterol），上述這些甾醇是目前微生物轉(zhuǎn)化的重要前體物質(zhì)。

第36頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.4.2甾醇類(lèi)或類(lèi)固醇化合物的生物轉(zhuǎn)化發(fā)展圖1.豆甾醇（Stigmasterol）

第37頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.4.2甾醇類(lèi)或類(lèi)固醇化合物的生物轉(zhuǎn)化發(fā)展關(guān)于微生物轉(zhuǎn)化甾體類(lèi)物質(zhì)的研究最早可以追溯到20世紀(jì)30年代，Mamoli和Vercellone在研究酵母菌發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌可以將17-ketosteroids還原為17β-hydroxystreroids，這種方法在生產(chǎn)雄性荷爾蒙、睪丸激素和雌性激素（如雌二醇）等方面具有重要的過(guò)渡意義，但之后迅速被高效、廉價(jià)的非酶合成方法取代。

第38頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.4.2甾醇類(lèi)或類(lèi)固醇化合物的生物轉(zhuǎn)化發(fā)展雖然開(kāi)始時(shí)微生物轉(zhuǎn)化的甾體類(lèi)物質(zhì)沒(méi)有能夠成功的工業(yè)化，但Mamoli等對(duì)甾體類(lèi)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)和發(fā)現(xiàn)性研究具有劃時(shí)代的意義，之后的1940-1949年，成立的Mamoli學(xué)院繼續(xù)在該領(lǐng)域的研究。第39頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.3.4.2甾醇類(lèi)或類(lèi)固醇化合物的生物轉(zhuǎn)化發(fā)展

1952年在美國(guó)厄普強(qiáng)藥廠(chǎng)（Upjohn）成功地利用無(wú)根根霉實(shí)現(xiàn)了由黃體酮到11α-羥基黃體酮的工業(yè)化過(guò)程，從此，微生物轉(zhuǎn)化甾體類(lèi)藥物得到了人們廣泛的重視。

生物轉(zhuǎn)化第40頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.4.2甾醇類(lèi)或類(lèi)固醇化合物的生物轉(zhuǎn)化發(fā)展一個(gè)有重要意義的藥物——可的松，也是在20世紀(jì)30年代，馬約基金會(huì)的EdwardC.Kendall和巴塞爾大學(xué)的TadeusReichstein分離到了由腎上腺分泌的可的松（共同獲得1950年的諾貝爾獎(jiǎng)）。1949年，馬約基金會(huì)的研究者們發(fā)現(xiàn)服用可的松可以減緩急性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀，對(duì)可的松的大規(guī)模需求，極大地刺激了化學(xué)合成激素技術(shù)的發(fā)展。

第41頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.4.2甾醇類(lèi)或類(lèi)固醇化合物的生物轉(zhuǎn)化發(fā)展最初化學(xué)合成可的松是一個(gè)需要31步反應(yīng)的復(fù)雜過(guò)程，而且收率很低，615kg的脫氧膽酸只能得到1kg的可的松醋酸酯，其市場(chǎng)價(jià)格在當(dāng)時(shí)是200美元/g。該合成工藝的主要難點(diǎn)在于將脫氧膽酸C12β羥基轉(zhuǎn)化至C11上，需要9步化學(xué)合成反應(yīng)。第42頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.4.2甾醇類(lèi)或類(lèi)固醇化合物的生物轉(zhuǎn)化發(fā)展

Murray和Peterson等成功地采用微生物轉(zhuǎn)化的方法一步完成了上述轉(zhuǎn)化過(guò)程，幾乎在同時(shí)施貴寶（Squibb）研究所的科學(xué)家也發(fā)現(xiàn)一種黑曲霉也能完成同樣的轉(zhuǎn)化，采用微生物羥化C11技術(shù)后，工業(yè)合成可的松的反應(yīng)步驟由31步縮短到11步，使可的松的市場(chǎng)價(jià)格降至6美元/g。第43頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.4.2甾醇類(lèi)或類(lèi)固醇化合物的生物轉(zhuǎn)化發(fā)展合成可的松的最初底物是由牛膽汁中純化得到的，因此價(jià)格很昂貴，可的松工業(yè)化過(guò)程的又一次質(zhì)變則根源于此，即由廉價(jià)的甾醇代替脫氧膽酸，其依托的技術(shù)仍然是微生物轉(zhuǎn)化。第44頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.4.2甾醇類(lèi)或類(lèi)固醇化合物的生物轉(zhuǎn)化發(fā)展甾醇類(lèi)物質(zhì)，如前面提到的豆甾醇（圖1）和谷甾醇，是大豆油生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，可以大量獲得，市場(chǎng)價(jià)格在20美元/kg左右。另外還有的植物甾醇是由多花薯蕷根得到的薯蕷皂苷等，從這些植物甾醇生產(chǎn)類(lèi)固醇必需除去C21位上連接的側(cè)鏈，生成雄甾烯酮類(lèi)物質(zhì)，如雄烯二酮（4-AD，圖2）。盡管采用化學(xué)降解等方式可以完成上述反應(yīng)，但采用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)更加具有優(yōu)勢(shì)。至20世紀(jì)80年代，可的松的價(jià)格已經(jīng)達(dá)到0.46美元/g。第45頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.4.2甾醇類(lèi)或類(lèi)固醇化合物的生物轉(zhuǎn)化發(fā)展圖2.雄烯二酮（4-AD）第46頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.4.2甾醇類(lèi)或類(lèi)固醇化合物的生物轉(zhuǎn)化發(fā)展通過(guò)甾體藥物分析，眾多的甾體藥物結(jié)構(gòu)被闡明，在這些甾體類(lèi)有機(jī)化合物中存在著旋光、手性、分子不對(duì)稱(chēng)性、消旋異構(gòu)和立體異構(gòu)等現(xiàn)象，單純采用有機(jī)合成方法完成這些立體專(zhuān)一性或?qū)τ尺x擇性反應(yīng)是非常困難，甚至是不可能的。生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中酶反應(yīng)具有的高度專(zhuān)一性和高效性保證了酶促反應(yīng)產(chǎn)物立體異構(gòu)的唯一性，同時(shí)常溫、常壓的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程比高溫、高壓和非水溶劑的合成體系費(fèi)用更低和易操作。第47頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.3.4.3一些的甾體藥物合成的相互關(guān)系第48頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.4生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在甾體藥物研究關(guān)鍵酶5.4.1關(guān)于細(xì)胞色素P450

細(xì)胞色素P450是一類(lèi)以還原態(tài)與CO結(jié)合后在波長(zhǎng)450nm處有吸收峰的含血紅素的單鏈蛋白質(zhì)。它于1958年被發(fā)現(xiàn),引起了人們的廣泛重視。近年來(lái)每年發(fā)表的有關(guān)細(xì)胞色素P450的研究論文已超過(guò)2000篇。細(xì)胞色素P450之所以引起人們極大興趣是因?yàn)樗谏矬w中具有重要的功能——對(duì)許多內(nèi)源性和外來(lái)物質(zhì)都存在代謝作用。它的廣泛分布、多樣的結(jié)構(gòu)、復(fù)雜的功能及其基因的多層次調(diào)控可以說(shuō)是其重要性的一些體現(xiàn)。

第49頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.4.1關(guān)于細(xì)胞色素P450

膜結(jié)合細(xì)胞色素P450可分為微粒體和線(xiàn)粒體細(xì)胞色素P450兩種類(lèi)型。線(xiàn)粒體細(xì)胞色素P450具有嚴(yán)格的底物專(zhuān)一性,它代謝內(nèi)源性甾醇類(lèi)物質(zhì),對(duì)外來(lái)物質(zhì)無(wú)代謝作用。而其它細(xì)胞色素P450特別是肝微粒體中的細(xì)胞色素P450則具有非常寬而重疊的底物專(zhuān)一性。第50頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.4.1關(guān)于細(xì)胞色素P450細(xì)胞色素P450是分子量為40～

60kD、結(jié)構(gòu)類(lèi)似的一族蛋白質(zhì)。近年來(lái),不斷有新的成員歸入細(xì)胞色素P450這一古老的基因超家族,至今已鑒定出400多種來(lái)自植物、動(dòng)物、細(xì)菌和酵母的細(xì)胞色素P450。Coon等指出細(xì)胞色素P450這一習(xí)慣沿用的名稱(chēng)已不能很好地表示這一類(lèi)物質(zhì)，而提出用多樣酶類(lèi)(diversozymes)來(lái)命名這一血紅蛋白家族。第51頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.4.1關(guān)于細(xì)胞色素P450人類(lèi)制造的環(huán)境化合物,估計(jì)已超過(guò)200000種,其中大多數(shù)是細(xì)胞色P450的可能底物,還有許多可能作為細(xì)胞色素P450不同同工酶的誘導(dǎo)劑或抑制劑。有些參與甾醇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞色素P450對(duì)底物有高度選擇性,而其它細(xì)胞色素P450特別是肝微粒體的細(xì)胞色素P450具有重疊的底物專(zhuān)一性。

第52頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.4.2細(xì)胞色素P450催化機(jī)制總體看,細(xì)胞色素P450可以催化成千上萬(wàn)的反應(yīng),甚至對(duì)具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的底物也表現(xiàn)出多種反應(yīng)類(lèi)型。細(xì)胞色素P450催化反應(yīng)過(guò)程涉及多個(gè)步驟,其作用機(jī)制有多種。典型的反應(yīng)是通過(guò)電子傳遞系統(tǒng)將分子氧還原,并將其中一個(gè)氧原子加到底物(RH)中,反應(yīng)需NADPH。RH+O2+NADPH+H+→ROH+H2O+NADP+第53頁(yè)，課件共61頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物轉(zhuǎn)化5.4.2細(xì)胞色素P450催化機(jī)制細(xì)胞色素P450其它的催