海洋細(xì)菌活性物質(zhì)

海洋細(xì)菌活性物質(zhì)的研究概況劉擁微生物與生化藥學(xué)2111007135海洋是生命之源，人類物質(zhì)資源的天然寶庫。海洋生物量約占地球生物總量的80%,生物種類20萬種以上，蘊(yùn)藏著豐富的藥用資源。但是，目前人們對海洋生物的認(rèn)識仍相當(dāng)有限，利用率僅1%左右。海洋生態(tài)環(huán)境十分獨(dú)特，海洋的特殊環(huán)境如高壓、低營養(yǎng)、低溫特別是深海)、無光照以及局部的高溫和高鹽等，造成了海洋微生物的多樣性和特殊性。使海洋微生物產(chǎn)生了與陸地微生物不同的代謝系統(tǒng)和防御體系，特別是從海洋微生物中提取的生物活性物質(zhì)，常常具有新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特異的生理功能，在抗菌、抗病毒、抗腫瘤、保健等方面具有獨(dú)特效應(yīng)，已成為開發(fā)新藥、特藥的主要研究方向之一。海洋細(xì)菌是海洋微生物中的優(yōu)勢類群，同時具有產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的巨大潛力，由于海洋細(xì)菌具有獨(dú)特的代謝途徑和遺傳背景，故可產(chǎn)生出不同結(jié)構(gòu)和功能的天然活性物質(zhì)，所以為尋找能解決目前疑難雜癥的藥物提供了豐富的資源，也為微生物工業(yè)化生產(chǎn)新藥開辟了一條嶄新道路。海洋細(xì)菌活性物質(zhì)的研究，是目前國際研究的熱點(diǎn)。1海洋細(xì)菌資源海洋中常見的細(xì)菌主要屬于以下幾個系統(tǒng)類群：變形細(xì)菌(Proteobacteria)類群、革蘭氏陽性細(xì)菌類群(包括高G+c和低G+c)、噬纖維菌屬一黃桿菌(Cytophaga-Flavobacterium)類群、浮霉?fàn)罹?Planctomycetales)/衣原體類群、疣微菌(Verrucomicrobiales)類群及一些人工尚未培養(yǎng)成功的系統(tǒng)類群等。其他一些細(xì)菌類群也存在于海洋生態(tài)環(huán)境中，但研究報道較少。早期人們從海水中分離得到的海洋細(xì)菌有9。％以上是革蘭氏陰性細(xì)菌，對這些細(xì)菌的研究較多也較集中。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)海洋中同樣存在許多革蘭氏陽性細(xì)菌，但大多分布于海洋沉積物和海洋生物共生系統(tǒng)中，并常在系統(tǒng)學(xué)上形成獨(dú)特的分支。海洋中的革蘭氏陽性細(xì)菌包括產(chǎn)芽孢和不產(chǎn)芽孢的屬群，主要有：芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌(Paenibavillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、消化球菌屬(Peptococcus)、微球菌(Micrococcus)、梭菌屬(Clostridium)、八疊球菌屬(Sarcina)、動性球菌屬(Planococcus)、鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)、放線菌屬(Actinomycetes)。2海洋細(xì)菌藥物研究2.1抗菌活性物質(zhì)抗菌活性物質(zhì)主要包括抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒物質(zhì)三類，其中主要以抗細(xì)菌活性物質(zhì)為主。許多海洋細(xì)菌可產(chǎn)生抗生素，包括鏈霉菌屬(Streptomyces)、交替單胞菌屬(Alteromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Flavobavterium)、微球菌屬、著色菌屬(Chromatium)、欽氏菌屬(Chainia)、Madurmacetes等菌及許多未定菌。已報道海洋細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素有漠化吡咯、a—n—pentylquinolind、magnesidins，istamycins，aplasmomycins，ahermicidin，macmlactins，diketoplperazines、3-氨基一3一脫氧一D—葡萄糖、oncorhynco|ide、maduralide、salinamides、靛紅、對羥苯基乙醇、醍、thiomarindsBC、trisindoline、pyrolnitrim等，其中有些種類在陸生菌中從未見過。Jaruchoktaweechai等從海泥里分離出一株芽孢桿菌(Bacillussp.)Sc026，并從其培養(yǎng)液中分離出3個大環(huán)內(nèi)酯化合物對枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制活性。Fudou等從海藻中分離出一種新屬黏細(xì)菌Halisngiumluteum，其培養(yǎng)液的丙酮浸膏中分離出一個新的抗真菌抗生素一Haliangicin。一些海洋細(xì)菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)對海洋微生物具有專一性抑制作用。Yoshikawa等從綠藻中分離到的一株交替假單孢菌，在75%人工海水培養(yǎng)基中可產(chǎn)生一種抗菌物質(zhì)，該物質(zhì)能抑制海洋細(xì)菌的生長而對陸地微生物不起作用。雖然海洋放線菌不是主要的海洋微生物區(qū)系，但近年來研究表明海洋放線菌代謝產(chǎn)物卻是尋找新抗生素的重要來源。頭孢菌素、硫酸小諾霉素就是由海洋放線菌分泌產(chǎn)生并已得到臨床應(yīng)用的抗生素。黃維真等從福建沿海海泥中分離到一株海洋放線菌 魯特格斯鏈霉菌鼓浪嶼亞種(S.rutgersensissubsp.gulangyunensis),能夠產(chǎn)生廣譜、低毒性的抗菌物質(zhì)Minobiosamine和肌醇胺霉素等，對綠膿桿菌和一些耐藥性革蘭氏陰性菌具有較強(qiáng)的活性；另外一株嗜堿性放線菌則能夠產(chǎn)生一種典型的氨基苷類抗生素。Kala從紅樹林底泥分離出的放線菌中獲得抗生素，對魚類病原菌等有一定的拮抗作用。2.2抗腫瘤活性物質(zhì)海洋細(xì)菌是海洋微生物抗腫瘤活性物質(zhì)的一個重要來源，主要集中在假單胞菌屬、弧菌屬(Vibrio)、微球菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬 (Enterubacrerium)、交替單孢菌屬(Alteromonas)、鏈霉菌屬、欽氏菌屬、黃桿菌屬和小單孢菌屬(Micromonospora)。Sesbanimide是CHIKATAKAHASHI等f3l1從兩株海洋土壤桿菌(分別分離自加勒比海海鞘Ecteinascidiaturbinata及Turkish海岸PolycitOhide屬海鞘)的脂溶性代謝產(chǎn)物中分離到兩個有顯著抗腫瘤活性的化合物SesbanimideA(1)和C(2)。1999年，CanedoLM等1321又從該屬中分離到的抗腫瘤噻唑生物堿化合物Agrochelin(3)，體外對小鼠白血病P388細(xì)胞、人(A549、HT29、MEL28)腫瘤細(xì)胞有顯著細(xì)胞毒性(O.O5—O.2mg/L)，但其乙?；苌?4)的細(xì)胞毒性卻大大減少(3?7mg/L)。Macrolactins是從深海(一1000m)細(xì)菌中分離到的系列大環(huán)內(nèi)酯類化合物.其中macrolactinA組分是一種配糖體母體，即有抗菌活性又能抑制316—F10黑色素癌細(xì)胞，還能保護(hù)T一淋巴細(xì)胞防止人類免疫缺陷病毒(HIV)的復(fù)制，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等功能。Halobacillin是從一株海洋芽孢桿菌(分離自墨西哥Guaymas海灣一124m深海污泥中)發(fā)酵物中分離到的Iturin族酰基化多肽，結(jié)構(gòu)特征是具有極性的環(huán)狀七肽和親脂的B一酰氧基或B一氨基脂肪酸，對人結(jié)腸癌細(xì)胞有中等細(xì)胞毒性(IC50=0.98mg/L)。Homocereulide和cereulide是從分離自潮間帶蝸牛體表的B.cereus的脂溶性提取物中分離到的2個具有極強(qiáng)細(xì)胞毒性的環(huán)肽，對P388和結(jié)腸26細(xì)胞的IC50為1—35pg/mL。PM—94128是從來自海洋污泥的芽孢桿菌(PhM—PhD一090)發(fā)酵液中分離到新的isocoumarin化合物，能抑制DNA及蛋白質(zhì)合成(對DNA的IC50=2.5pmol/L，對蛋白質(zhì)的IC50=0.1umol/L)，對多種腫瘤細(xì)胞均有明顯的細(xì)胞毒性(P388、HT29、MEL28的IC50均為0.05umol/L)oAlteramideA是從海洋互生單胞菌屬Aheromonassp.(分離自日本北海道海綿Halichondriaokadai)中分離到的的四環(huán)內(nèi)酰胺生物堿，在體外對小鼠白血病P388細(xì)胞、人淋巴瘤L1210及人表皮癌KB細(xì)胞有細(xì)胞毒性(IC50分別為0.1，1.7,5.0mg/L)。Macrolactins是從深海(一1000m)細(xì)菌分離到的一組抗菌抗腫瘤抗病毒化合物，是罕見的24元大環(huán)內(nèi)酯，含有3對兩兩共軛的烯鍵。其中MacrolactinA不但有抗菌活性，而且在體外有顯著抑制B16一F10黑色素瘤細(xì)胞活性(IC5o=3.5mg/L)oPelagiomicins是從海洋新屬革蘭氏陰性海洋嗜鹽菌Pelagiobacterariabilis(分離自帕勞群島的巨藻Pocockiellavariegata)分離到的一組吩嗪類化合物其中Pelagiomicins入在體內(nèi)對宮頸癌Hela細(xì)胞,BALB3T3及BALB3T3/H—ras細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒性(Ic50分別為0.04,0.2，0.07mg/L)，但在體內(nèi)對P388細(xì)胞僅有微弱的抗腫瘤活性。2.3抗癌變活性物質(zhì)研究國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從海洋細(xì)菌、放線菌和真菌的培養(yǎng)物中分離到大量的活性物質(zhì)，有些結(jié)構(gòu)罕見，有些活性獨(dú)特，有些兼而有之。美國加州大學(xué)(SanDiego分校)W.Fenical教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組從約1m深的紅樹林淤泥中分離得到1株新海洋細(xì)菌SalinosporaCNB-392，并從其培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)骨架全新、活性很強(qiáng)的抗癌物。此后2a即有學(xué)者報道該化合物的全合成和比較深入的構(gòu)效關(guān)系研究”，同時還吸引了多位藥理學(xué)家對其作用特點(diǎn)進(jìn)行了比較深入的研究。2.4抗HIV微生物研究在過去的20多年里，人們對HIV發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了深入研究，為艾滋病藥物的開發(fā)提供了契機(jī)。由于至今尚無理想的艾滋病動物模型，抗藥物的篩選和研究仍然主要依賴于各種體外(invitro)的活性研究。KGustafson等從1株未經(jīng)分類鑒定的深海細(xì)菌純化出幾個次級代謝產(chǎn)物MacrolactinesA-F，MacrolactinesA.F共同結(jié)構(gòu)是1個24C的大環(huán)內(nèi)脂。其中MacrolactinesA表現(xiàn)較強(qiáng)的抗HIV活性，保護(hù)淋巴細(xì)胞的最高濃度為10pg/mL。目前，已在海藻中發(fā)現(xiàn)了不少具有抗HIV活性的天然產(chǎn)物。代表性的如藍(lán)藻門(Cyanophyta)的鞘絲藻(Lyngbyasp.)、纖細(xì)席藻(Phormidiumtenuemenegh)和鈍頂螺旋藻(Spirulinaplaltensis)，經(jīng)藻門植物，褐藻門(Phaeophta)的海帶(Iaminariajaponica)等，其活性成分為硫酸多糖。2.5酶在海洋生態(tài)環(huán)境下，極端微生物的發(fā)現(xiàn)和研究，促進(jìn)了新酶源的開發(fā)應(yīng)用。海洋細(xì)菌產(chǎn)生的酶常常具有特殊的理化性質(zhì)，特別是在極端環(huán)境下的高活性和穩(wěn)定性。各國在海洋蛋白酶領(lǐng)域都有較多的研究，其中以低溫蛋白酶的研究最多。這些產(chǎn)蛋白酶海洋細(xì)菌通常具有嗜低溫的特性，有些海洋細(xì)菌適宜在偏堿性的條件下生長并產(chǎn)酶。筆者在這方面也進(jìn)行了相關(guān)的研究，取得了可喜的進(jìn)展。某些高溫蛋白酶的酶活性和熱穩(wěn)定性可隨壓力升高而提高，而且升壓可以提高深海細(xì)菌某些酶的產(chǎn)量。另外，Sunog等從海洋交替假單胞菌(Pseudoalteromonassp.)A28分離出一種蛋白酶，還具有殺滅S.cosumNIES-324的活性。王鵬等篩選到一株產(chǎn)巖藻多糖酶的海洋芽孢桿菌，可用于催化生產(chǎn)低分子質(zhì)量的巖藻多糖。醫(yī)藥上用于治療消化不良、食欲不振的纖維素酶、脂肪酶I2也逐漸在海洋細(xì)菌中尋求發(fā)現(xiàn)。日本科學(xué)家Sugan。等較為系統(tǒng)地研究了海洋弧菌(Vibriosp.)JT0107的瓊脂糖酶。楊承勇等從南海海水中分離到產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的弧菌(Vibriosp.)。此外，新型堿性金屬內(nèi)肽酶、堿性磷酸酶、海藻解壁酶、葡萄糖降解酶、甘露聚糖酶、過氧化物酶、褐藻膠裂解酶等各種酶類在海洋細(xì)菌中均有發(fā)現(xiàn)。2.6酶抑制劑在酶抑制劑研究這方面有突出貢獻(xiàn)的是日本梅澤賓夫的工作，他們篩選了50多種酶抑制劑，已應(yīng)用于臨床的有tation。Cathestatins是海洋細(xì)菌產(chǎn)生的一種熱穩(wěn)定性的組織蛋白酶抑制劑，在治療骨病等方面具有一定的應(yīng)用前景33-。Dioetatin是一種分離自放線菌的新型物質(zhì)，對二膚酰氨基膚酶有抑制作用，可望用于治療關(guān)節(jié)炎等疾病。在海洋假單胞菌中，一種新型的幾丁質(zhì)酶抑制劑也被發(fā)現(xiàn)。分離自日本油壺灣海水水樣的一種交替單孢菌B-1-31，能產(chǎn)生蛋白酶抑制劑marinostatins，這是多組分的活性物質(zhì)，研究結(jié)果表明marinostatinC活性位點(diǎn)的氨基酸序列明顯地不同于陸棲微生物產(chǎn)生的蛋白酶抑制劑。Kobayashi等從一種黃桿菌(Flavobacteriumsp.)中分離出flavoefistamidesA和B，其對真核DNA復(fù)制酶一DNA聚合酶a顯示出抑制活性。Kono等從海洋細(xì)菌SANK71896的培養(yǎng)液中分離出了一系列新的活性代謝物B—5354a、b和c，均能抑制鞘氨醇激活酶，其，IC5(分別為21、58、38umol/L。此外半胱氨酸蛋白酶抑制劑B1371A和B1371B、新的內(nèi)皮肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑B90063等諸多酶抑制劑都從海洋細(xì)菌培養(yǎng)液中分離得到。因此海洋細(xì)菌成為新型酶抑制劑篩選的一個重要來源。2.7多不飽和脂肪酸(PUFA)海洋多不飽和脂肪酸(Polyunsaturatedfattyacid,PUFA)的代表是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。海洋細(xì)菌中的EPA是磷脂型的，優(yōu)于魚類的中性脂質(zhì)EPA，沒有特殊的魚腥味，因此從海洋細(xì)菌中獲取EPA和DHA具有廣闊的應(yīng)用前景。1973年，Oliver等在海洋細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)有多不飽和脂肪酸存在。1977年，Johns等從海洋的多形屈撓桿菌(Flexibacterpolymorphus)分離得到EPA，證明了原核生物也具有合成PUFA的能力。目前發(fā)現(xiàn)的PUFA產(chǎn)生菌全部是深海細(xì)菌和極地細(xì)菌。Rossello—Mora等通過5s和16SrDNA序列分析，確認(rèn)這些海洋細(xì)菌為革蘭氏陰性菌，分別屬于：Colwellia、希瓦氏菌(Shewanella)、交替單胞菌、交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)和Ferrimonas。其中Co2wellia和希瓦氏菌被認(rèn)為是生產(chǎn)PUFA的主要海洋細(xì)菌種屬。Yazawa1分離到的一株海洋細(xì)菌中，EPA含量占總脂的24%—40%，占細(xì)胞干重的2%。2.8脂肽類生物表面活性劑生物表面活性劑是一類集疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)于一身的兩親化合物，一般是由微生物(尤其是一些細(xì)菌和真菌)在一定培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，通常為糖脂、磷脂、多糖脂復(fù)合物、脂蛋白一脂多肽、羥基化合物和交聯(lián)脂肪酸等脂肽類生物表面活性劑細(xì)菌的信號傳導(dǎo)和遺傳控制是在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行的，脂肽類生物表面活性劑合成酶基因與細(xì)菌多種代謝途徑均有相關(guān)性。脂肽類生物表面活性劑的親水基團(tuán)由短肽或氨基酸組成，疏水基團(tuán)由脂肪酸組成，一種脂肽往往是多種異構(gòu)單體組成的混合體。由于脂肽中的脂肪酸鏈長和支鏈數(shù)量以及氨基酸的組成具有多變性，致使脂肽表面活性劑的種類繁多。具有代表性的脂肽有 surfactin，lichenysin，fengycin，iturin，mycosubtilin,Z及bacillomycin等。其中，B.subtilis產(chǎn)生的surfactin在sigma公司已經(jīng)商品化。大多的脂肽具有抗菌活性，例如surfactin具有明顯的抗細(xì)菌活性；fengycin有抗絲狀真菌和抑制磷脂酶A2芳化酶活性的能力。迄今為止，關(guān)于脂肽抗菌活性及生理作用已有很多報道?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的脂肽主要來Bacillus屬，如B.subitilis、B.circulans，B.cereus，B.polymyxa，B.mesentericus等，這些Bacillus產(chǎn)生的脂肽類生物表面活性劑結(jié)構(gòu)、功能及生理作用列于表1口u。除-j"Bacillus產(chǎn)生脂肽外，其他一些種類的微生物也產(chǎn)脂肽。例jIHMycobacteriumfortuirum，Streptomycescanus、Pseudomonasfluorescens、Serratiamarcescens等。脂肽類生物表面活性劑主要是細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，它具有四種顯著的生理功能：①降低表面張力，使微生物吸收和代謝水不溶性物質(zhì)(如烷烴、多環(huán)芳烴)，利于微生物在水不溶性物質(zhì)中生存；②具有抗微生物和昆蟲活性，Bernheimer和其他微生物和外援DNA，因此進(jìn)一步研究感受態(tài)形成與脂肽的產(chǎn)生的關(guān)系將有助于分析B.subtilis的遺傳學(xué)特性。另外，由于脂肽的高表活性，科學(xué)家們預(yù)測這以特性將被應(yīng)用在油田開發(fā)中。地衣芽孢桿菌BAS50產(chǎn)生的JF—2脂肽類表面活性劑的室內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明其具有明顯的增產(chǎn)原油作用。2.9毒素海洋生物毒素一直是海洋活性物質(zhì)研究的焦點(diǎn)之一.目前發(fā)現(xiàn)，許多海洋生物毒素的真正來源是海洋中游離的或附生在海洋生物上的海洋微生物所產(chǎn)生!其中研究較多的是河豚毒素！河豚毒素(terrodotoxinTTX)是一種毒性很強(qiáng)的海洋生物活性物質(zhì)，為典型的神經(jīng)Na+通道阻斷劑，毒性為NaCN的1250倍，對人的致死量為0.3mg，臨床藥用價值很高，可用作鎮(zhèn)痛劑、鎮(zhèn)痙劑、搔癢鎮(zhèn)靜劑、呼吸鎮(zhèn)靜劑等，并具有充血功能、尿意鎮(zhèn)靜作用及抗心律失常作用等，另據(jù)報道，河豚毒素還有抗癌作用，對肝癌抑制率在37%以上，對肉瘤180的抑制率在30%以上.近年來，人們從含有河豚毒素的叉珊藻、毒蟹、河豚、毛顎動物等的體內(nèi)或體表分離出的一些細(xì)菌中，檢測出河豚毒素及其類似物，推測河豚毒素的產(chǎn)生與含毒生物體內(nèi)共生存的微生物及其食物鏈有關(guān)，目前這一觀點(diǎn)已為大多數(shù)學(xué)者所接受!目前已報道的能夠產(chǎn)生河豚毒素的細(xì)菌有假單胞菌屬(Pseudomonas)、弧菌屬(Vibrio)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、別單胞菌屬(Alteromonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等.Juntongjin在海洋生物、海水和底質(zhì)中發(fā)現(xiàn)多株能夠產(chǎn)生鈉離子通道阻斷性毒素的細(xì)菌.這些毒素主要是TTX及其衍生物..根據(jù)毒素的微生物起源學(xué)說，如果從自然界或通過基因工程技術(shù)篩選一些TTX高產(chǎn)菌株，直接從微生物發(fā)酵液中提取TTX，則可大大提高產(chǎn)量，簡化提取工藝。日本海洋生物工程研究公司已利用海洋細(xì)菌進(jìn)行TTX生產(chǎn)。3.0其他活性物質(zhì)從海洋細(xì)菌中分離篩選的天然活性產(chǎn)物還有多糖、維生素、氨基酸等，如：MikiW等(1996)從一種屈撓桿菌(Flexibactersp.)分離出類胡蘿卜素。4存在問題和展望海洋細(xì)菌有產(chǎn)生多種新穎獨(dú)特的生物活性物質(zhì)的巨大潛力，在藥物開發(fā)研究中具有良好的應(yīng)用前景，吸引了國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行了大量的研究和開發(fā)，但仍存在著一些問題：(1)活性物質(zhì)篩選等基礎(chǔ)性工作薄弱，有必要建立系統(tǒng)化、規(guī)?；?、高通量的活性物質(zhì)篩選方法。(2)利用現(xiàn)代生物技術(shù)手