甘薯脫毒技術(shù)“衡水賽”一等獎

作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫甘薯脫毒技術(shù)靳改龍2019.2

甘薯脫毒技術(shù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫甘薯生產(chǎn)技術(shù)(一）甘薯脫毒的重大意義“脫毒甘薯”指的是通過組培技術(shù)得到的植株，并經(jīng)過嚴(yán)格的病毒檢測、確認不帶有某些病毒的甘薯及其在無蚜蟲條件和無病源土壤繁育的后代。

甘薯脫毒技術(shù)是生物技術(shù)、病毒學(xué)技術(shù)和良種繁育技術(shù)有機結(jié)合的產(chǎn)物。經(jīng)過脫毒一般可增產(chǎn)20％～30％，并對其外觀、商品性還有所改善。因此，選用脫毒甘薯良種是取得甘薯高產(chǎn)的前提。由于甘薯本身無性繁殖的特點，甘薯品種一旦感染病毒后，病毒即在體內(nèi)積累并通過薯塊代代相傳。病毒病不同于真菌和細菌病害，無法用殺菌劑和抗生素予以防治。雖然有些化學(xué)物質(zhì)如人工合成的藥劑以及某些提取的天然物質(zhì)能抑制病毒增殖，但由于病毒不具有細胞結(jié)構(gòu)，它的核酸入侵寄主后，利用寄主的代謝功能復(fù)制自己，因此，它和寄主的依存關(guān)系更為密切，雖然很多藥劑能使病毒在體外失活，但施用于感染病毒的寄主以防治病毒病，亦對寄主具有嚴(yán)重的毒害作用。目前尚無有效的化學(xué)藥劑防治病毒病，生產(chǎn)中也缺少高抗或免疫的甘薯品種。防治甘薯病毒病最有效的途徑是培養(yǎng)、推廣脫毒甘薯，從根本上克服病毒病對甘薯生產(chǎn)造成的危害，關(guān)鍵是要獲得無病毒種苗。無病毒種苗是產(chǎn)生健康植株的前提和基礎(chǔ)，而且由于無病毒種苗投放生產(chǎn)后，又會逐漸感染病毒，因此，只有保證能源源不斷地為生產(chǎn)提供無病毒種苗，才能獲得甘薯的持續(xù)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，充分發(fā)揮甘薯的生產(chǎn)潛力作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫甘薯生產(chǎn)技術(shù)（二）甘薯脫毒的原理早在20世紀(jì)40年代，就有研究發(fā)現(xiàn)病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻的，在染病的植株中，愈靠近莖尖病毒含量越低，頂端分生組織不帶病毒或僅有少量病毒，隨組織的老化，病毒含量增加。莖尖分生組織不帶毒或很少帶毒的可能原因是：在旺盛生長的分生組織細胞中，細胞的代謝活性很高，病毒的復(fù)制速度趕不上細胞的生長速度，另外，病毒在甘薯體內(nèi)主要通過維管束組織和胞間連絲途徑運轉(zhuǎn)，而在莖尖分生組織中維管束尚未形成，胞間連絲的傳導(dǎo)速度低于莖尖的快速生長，這速度之差就形成了莖尖無病毒區(qū)。甘薯脫毒苗的培養(yǎng)是利用甘薯莖尖導(dǎo)管組織不健全，病毒顆粒不易通過，甘薯莖尖不帶或很少帶病毒的原理,削離莖尖培養(yǎng)甘薯莖尖苗,對莖尖進行病毒檢測,選出不帶病毒的莖尖進行快速繁殖后在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用利用以上所述莖尖存在無病毒區(qū)的現(xiàn)象，結(jié)合細胞全能性理論，在無菌條件下切取甘薯莖尖進行離體培養(yǎng)，即可得到不帶病毒的植株。1960年NielSen用莖尖培養(yǎng)成功獲得甘薯無病毒植株，此后，國內(nèi)外許多研究者在這方面做了大量卓有成效的工作。研究表明，莖尖離體培養(yǎng)可有效地去除甘薯體內(nèi)的病毒，目前甘薯莖尖分生組織脫毒技術(shù)已進入實用階段。甘薯脫毒技術(shù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫甘薯生產(chǎn)技術(shù)（三）甘薯莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)1.甘薯脫毒的準(zhǔn)備①器具條件除了高壓滅菌鍋、超凈工作臺、鑷子、解剖針、長柄刀片等植株組織培養(yǎng)所需的一般工具外，由于須剝離只帶1～2個葉原基的莖尖分生組織，大小只有0．1—0．3毫米，所以。還需要準(zhǔn)備1臺雙目解剖鏡。②培養(yǎng)基的配制甘薯莖尖分生組織培養(yǎng)目前常用的為MS培養(yǎng)基，由于在莖尖培養(yǎng)及試管微繁中需要經(jīng)常配制培養(yǎng)基，為方便起見，一般將培養(yǎng)基組分先配成比所需濃度高的母液，配制培養(yǎng)基時只要按比例量取即可。一般將大量元素[MS(一)]配制成10倍溶液，F(xiàn)e鹽[MS(二)]、微量元素[MS(三)]及維生素[MS(四)]配成100倍溶液，分別存放。具體配方如下：

MS(一)：

NH4N031650×10=16500毫克

KNO31900×10=19000毫克

CaCl2·2H20440×10=4400毫克

M克S04·7H20370×10=3700毫克

KH2P04170×10=1700毫克稱取以上藥品，順序溶解后定溶至1000毫升，即成MS(一)10倍母液，取量100毫/升。甘薯脫毒技術(shù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫甘薯生產(chǎn)技術(shù)（三）甘薯莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)MS(二)：

FeS04·7H2027．8×100=2780毫克

Na2一EDTA37．3×100=3730毫克按以上重量稱取藥品分別溶解后，置火上煮20～30分鐘，以使Fe鹽充分絡(luò)合，呈黃亮溶液。冷卻后定容至1000毫升，為100倍Fe鹽母液，取量10毫升／升。

MS(三)：

H3B036．2×100=620毫克

MnS04·4H2022．3×100=2230毫克

CoCl2·6H200．025×100=2．5毫克

CuS04·5H200．025×100=2．5毫克

ZnS04·7H208．6×100=860毫克

Na2Mo04·2H200．25×100=25毫克

KI0．83×100=83毫克分別溶解后定容至1000毫升，取量10毫升／升。甘薯脫毒技術(shù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫甘薯生產(chǎn)技術(shù)（三）甘薯莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)Ms(四)：維生素B1O．1×100=10毫克維生素B60．5×100=50毫克煙酸0．5×100=50毫克甘氨酸2．0×100=200毫克溶解后定容至1000毫升，取量100毫升／升。肌醇可在配制培養(yǎng)基時加入，以免引起母液渾濁。母液配制好后，分別貼上標(biāo)簽，標(biāo)明母液號、倍數(shù)、取量及配制日期，置于冰箱備用。生長調(diào)節(jié)物質(zhì)也如上所述分別制成一定濃度的母液備用。配制培養(yǎng)基時，先稱取6克／升瓊脂粉加水溶解，并煮沸，以避免濃度不勻，然后按母液順序依次量取規(guī)定的量后加入已溶解的瓊脂中，最后加入30克／升蔗糖，定容至所配制體積。甘薯莖尖培養(yǎng)基pH值以5.8為宜，可用NaOH或HCl調(diào)節(jié)，然后用pH值試紙或酸度計進行pH值測試。培養(yǎng)基趁熱分注后進行高壓滅菌，一般保持7.84×104～10.78×104pa壓力，20分鐘既可達到滅菌效果，培養(yǎng)基也不受破壞。蒸餾水和器具消毒以30分鐘為宜。甘薯脫毒技術(shù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫甘薯生產(chǎn)技術(shù)（三）甘薯莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)③外植體取材與消毒甘薯外植體取自苗床、大田植株或人工控制條件下薯塊產(chǎn)生的幼芽均可，以生長健壯為宜，過弱不易剝?nèi)∏o尖，莖尖接種后也不易成活。外植體進行消毒的原則是既要達到良好的消毒效果，又要將對外植體的毒害限制在最低限度，保持較高的成活率。具體方法如下：剪取2～3厘米芽段，去除較大葉片后，對頂芽進行表面消毒。先將芽段置于燒杯中，加入少量洗衣粉、洗滌劑振蕩洗滌15分鐘，然后用清水沖洗干凈，置超凈工作臺備用。在超凈工作臺上，選用70％酒精浸泡30秒(酒精有很強的穿透力，切記時間不可過長)，然后用2％次氯酸鈉溶液浸10分鐘或0．1％氯化汞浸6分鐘，其間要不斷振蕩，最后用無菌水沖洗3～4遍。次氯酸鈉能分解產(chǎn)生具有殺菌作用的氯氣而揮發(fā)掉，相對比較安全，副作用??；氯化汞較難去除，且毒力很強，易對外植體產(chǎn)生毒害，處理時間不宜過長。在實際操作中，由于莖尖分生組織有彼此重疊的葉原基嚴(yán)密保護，消毒方法可視外植體的來源靈活掌握，如人工控制條件下薯塊產(chǎn)生的幼芽比從大田所取外植體雜菌污染機會要少，只要操作仔細，即可避免接種莖尖發(fā)生污染。甘薯脫毒技術(shù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫甘薯生產(chǎn)技術(shù)(2)脫毒甘薯的生產(chǎn)脫毒甘薯的生產(chǎn)過程包括優(yōu)良品種篩選、莖尖苗培育、病毒檢測、優(yōu)良莖尖苗株系評選、高級脫毒試管苗速繁、原原種、原種和良種種薯及種苗的繁殖等8個環(huán)節(jié)，每個環(huán)節(jié)都有嚴(yán)格的要求，最終目的是保證各級種薯的質(zhì)量，充分發(fā)揮脫毒甘薯的增產(chǎn)潛力①選用優(yōu)良品種甘薯優(yōu)良品種很多，而且經(jīng)過脫毒后都能不同程度地提高產(chǎn)量、改善外觀品質(zhì)。但甘薯品種都有一定的區(qū)域適應(yīng)性和生產(chǎn)實用性，在進行甘薯脫毒時一定要根據(jù)本地區(qū)氣候、土壤和栽培條件，選用適合本地區(qū)大面積栽培的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種或具有特殊用途的品種。②莖尖苗培育

在超凈工作臺上，把幼芽置于解剖鏡下，一手用一把短鑷子將其固定，另一手用解剖針剝離包被莖尖的葉片及葉原基，當(dāng)半透明狀的頂端分生組織充分暴露之后，用長柄手術(shù)刀片將帶l～2個葉原基，長0．1～0．3毫米莖尖切下，接種在附加1～2毫克／升6一BA的MS培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)，26～28℃下光培養(yǎng)，莖尖膨大變綠后轉(zhuǎn)入無激素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)成莖尖試管苗。待苗長至5～6片葉時移至營養(yǎng)缽內(nèi)進行病毒檢測。一般來講，從剝莖尖到誘導(dǎo)出5～7片葉的莖尖苗至少要用60～90天。利用分生組織培養(yǎng)誘導(dǎo)甘薯莖尖苗是甘薯脫毒的技術(shù)關(guān)鍵。而且甘薯莖尖苗的培育需要有設(shè)備完善、儀器齊全的組織培養(yǎng)室，技術(shù)水平較高，投資較大，一般單位特別是基層單位不必要開展此項研究，可以從有條件的單位索取已經(jīng)鑒定確認的脫毒試管苗或原原種進行繁育。甘薯脫毒技術(shù)作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫作物生產(chǎn)技術(shù)專業(yè)/教學(xué)資源庫甘薯生產(chǎn)技術(shù)③病毒檢測莖尖分生組織培養(yǎng)得到的莖尖苗并不都是脫毒苗，只有部分苗不含病毒，是脫毒苗；莖尖苗必須經(jīng)過嚴(yán)格的病毒檢測確認不帶病毒后，才是脫毒莖尖苗。莖尖苗的檢測一般首先采取目測法淘汰弱苗和顯癥苗，然后再用血清學(xué)方法或分子生物學(xué)方法進行篩選。經(jīng)血清學(xué)或分子生物學(xué)方法檢測呈陰性的樣品再進行指示植物嫁接檢