PCR、載體構建及轉化

PCR、載體構建及轉化

1.目的基因分離(PCR）2.載體構建3.轉化1.目的基因分離(PCR）TherewasatimewhentoamplifyDNA,

Youhadtogrowtonsandtonsoftinycells.

ThenalongcameaguynamedDr.KaryMullis,

Saidyoucanamplifyinvitrojustaswell.

Justmixyourtemplatewithabufferandsomeprimers,

Nucleotidesandpolymerases,too.

Denaturing,annealing,andextending.

Wellit’samazingwhatheatingandcoolingandheatingwilldo.

PCR,whenyouneedtodetectmutations.

PCR,whenyouneedtorecombine.

PCR,whenyouneedtofindoutwhothedaddyis.

PCR,whenyouneedtosolveacrime從前你要擴增DNA，

總有培養(yǎng)大批細胞的重任要你背。

這時有個家伙叫KaryMullis博士的，

他鉆出來說體外合成也一樣OK！

只要把你的模板混上緩沖液，再加些引物，還有核苷酸和聚合酶。變性，退火，和延伸。

加熱-冷卻-加熱太神奇了！

當你想要檢測突變，來啊做PCR吧！

當你想要基因重組，來啊做PCR吧！

當你想知道孩子他爹到底是誰，來啊做PCR吧！

當你想要偵破大案，來啊做PCR吧！PCR之歌目的基因分離(PCR）PCR技術的原理溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應的溫度循環(huán)周期PCR反應的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應延伸三個步驟完成的。圖中設定的反應參數是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復始，重復進行，直至擴增產物的數量滿足實驗需求為止。引物設計常用軟件：DNAstar：序列分析Primer5.0：引物設計DNAman：序列比對在線引物設計：http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/2.載體構建T-Vector連接反應體系：2×LigationBuffer2.5μlInsetfraction1.5μlT-easyvector0.5μlT4-ligase0.5μl混勻后置16℃連接0.5-小時。熱擊轉化大腸桿菌大腸桿菌感受態(tài)制備細菌細胞在一定的生理狀態(tài)（感受態(tài)），或經CaCl2處理，或制備成原生質體的情況下，都可吸收外源ＤＮＡ，利用這一特性可將重組ＤＮＡ導入受體細胞中，用質粒作載體的遺傳工程一般使用這種方法。由于E.coli不會自發(fā)地產生感受態(tài)，因此E.coli的轉化一般采用鈣轉化法。該方法是將E.coli用冷CaCl2(0℃)致敏，而后在高溫（42℃）下熱休克，這樣可使外原DNA進入受體細胞。涂平板（帶抗性ampr）（一）準備工作：1、制好的帶選擇壓得平板，涂布器，ITPG，X-Gal器；槍頭，塑料板，酒精燈、記號筆，封口膜等，2、提前打開37℃培養(yǎng)箱（二）步驟1、把相關用具放入超凈臺，開紫外燈，10min.2、將ITPG從-20℃取出溶化。3、到時間后，燒涂布器，4、從4℃取出平板，置臺上。5、取40μlX-Gal于平板中央，6、取16μlITPG加入到40μlX-Gal上，涂勻上述液體，直到板面發(fā)澀為止。7、將熱擊產物100μl加于平板上，涂布均勻。8、涂好的板封口后標記好質粒種類、日期，制作人，倒置于37℃培養(yǎng)14小時。藍白斑篩選：野生型大腸桿菌產生的β-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal切割成半乳糖和深藍色的物質5-溴-4-靛藍。設計適用于藍白斑篩選的基因工程菌為β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，無法作用于X-gal產生藍色物質。操作中，添加IPTG以激活lacz‘中的β-半乳糖苷酶的啟動子，在含有X-gal的固體平板培養(yǎng)基中菌落呈現藍色（空載）。當外源DNA與含lacz‘的載體連接時，會插入進MCS，這種重組質粒不再表達α肽鏈，不產生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培養(yǎng)基中的X-gal產生藍色，培養(yǎng)表型即呈現白色菌落。挑菌準備工作:1、提前打開37℃搖床，開紫外燈殺菌。2、滅菌的帶蓋的刻度試管，試管架，消毒的黃槍頭，鑷子，Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基。步驟：1、將Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基分裝入試管，每管4-6ml。2、用黃色的槍頭挑白色的單克隆，連帶槍頭放入試管中。3、蓋上試管蓋，置搖床中，37℃，170轉搖培過夜（16-18小時）。質粒DNA提取采用改良的SDS堿裂解法，結合生物膜選擇性吸附DNA旋轉離心柱技術快速純化質粒DNA。

質粒DNA提取準備：1、檢查試劑是否齊全，夠用，-20℃預冷的無水乙醇2、滅菌的小三角瓶、槍及槍頭、計時器、塑料插板、記號筆、吸水紙、盛冰盒3、計算SII的用量（NaOH,SDS）步驟：1、在超凈臺內將試管中的菌液移入1.5ml離心管中，2、1000rpm離心1.0min,其間取SI，和RNaseA,3、棄上清，留沉淀4、每管加入100μlSI和RNaseA0.4μl（RNaseA濃度為10.0mg/ml）（可提前算好總的SI和RNaseA用量，混勻后分裝于離心管中）5、充分渦旋均勻，6、計算好SII用量，臨時將0.4NNaOH,2%SDS等體積混合于滅菌的三角瓶中，7、每管加入混合好的SII200μl，輕輕上下顛倒幾次質粒DNA提取8、插入冰盒中，靜置5min,此時菌液變的清亮粘稠9、每管加入SIII150μl，上下顛倒數次，此時有白色絮狀沉淀出現。10、冰浴5min11、13000rpm5min12、吸上清液于新離心管（約420μl）13、加入2倍體積-20℃預冷的無水乙醇，上下顛倒，混勻，-20℃置30min以上。14、13000rpm5min，可見白色沉淀15、留沉淀，棄上清，加入70%乙醇900μl懸浮沉淀16、13000rpm5min17、棄上清，留沉淀，風干后呈透明無色。18、加入30μlMQW，溶解沉淀。酶切鑒定準備：1、提前開37℃水浴，2、檢查藥品、用具是否齊全3、合理安排時間，一般晚上做，37℃水浴過夜。4、盛冰盒。實驗在冰上進行。步驟：1、反應體系(20μl)10×BufferH2.0μlBSA0.2μlECORI0.5μlMQW16.3μl質粒DNA1.0μl目的：檢測克隆片斷大小的準確性酶切結果檢測測序取菌液若干個送生物公司測序填寫測序單GateWay載體構建:

通過去除冗長的亞克隆步驟節(jié)省時間

同時將您的基因轉移到多個表達系統(tǒng)

任何系統(tǒng)――體外，細菌，酵母，昆蟲，或哺乳動物――分析表達GateWay載體構建:完成構建Gateway表達克隆僅需兩步：（1）創(chuàng)建入門克隆，通過PCR或傳統(tǒng)的克隆方法將目的基因克隆進入門載體。（2）混合包含目的基因的入門克隆和合適的目的載體以及GatewayLRClonase酶，構建表達克隆。GateWay載體構建:常用載體：入門載體（BP反應）Pdnor222.1表達載體（LR反應）PMDC32（超量表達）PMDC164（啟動子分