開題報(bào)告修改02常黎明

冬蟲夏草子座發(fā)育前后轉(zhuǎn)錄組基因文庫(kù)的構(gòu)建以及表達(dá)差異的研究專業(yè)：微生物學(xué)導(dǎo)師：謝放副教授姓名：常黎明1、轉(zhuǎn)錄組的特點(diǎn)及意義What？Why？How？轉(zhuǎn)錄組是指在某一生理?xiàng)l件下某物種產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄本的集合。廣義的轉(zhuǎn)錄組主要包括信使RNA（mRNA）、非編碼RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）及核糖體RNA（rRNA）。狹義的轉(zhuǎn)錄組主要指信使RNA（mRNA）。與基因組是的靜態(tài)不同，轉(zhuǎn)錄組可以隨物種自身發(fā)育或外部環(huán)境條件的變化而有所轉(zhuǎn)變，同一物種在不同發(fā)育階段或不同環(huán)境中其基因表達(dá)情況存在很大差異，具有很強(qiáng)的時(shí)間和空間特性。轉(zhuǎn)錄水平的變化是生物基因組與外部物理特征的動(dòng)態(tài)聯(lián)系，可反映生物個(gè)體在某一發(fā)育或生理階段所有基因的表達(dá)水平。因此，掌握了特定生物轉(zhuǎn)錄水平的變化，就可以深入了解其生命活動(dòng)特征和調(diào)控機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究?jī)?nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面：新基因的預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)分析（SNP分析、轉(zhuǎn)錄組中存在的可變剪接分析、基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化等）物種差異表達(dá)基因注釋和富集分析差異表達(dá)基因表達(dá)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)UTR（untranslatedregion）分析2、研究背景

冬蟲夏草是由冬蟲夏草菌侵染青藏高原高山草甸土中的鱗翅目蝙蝠蛾（主要為鉤蝠蛾屬ThitarodesViette）幼蟲并在蟲體內(nèi)生長(zhǎng)產(chǎn)生子座而形成的幼蟲尸體與真菌的復(fù)合體。

作為一種未能實(shí)現(xiàn)人工化栽培的名貴藥用真菌，冬蟲夏草相關(guān)的研究都只是集中在菌種的分離鑒定、寄主昆蟲種類的確定和人工繁殖、菌株培養(yǎng)特性、代謝產(chǎn)物分離分析及活性成分藥理作用、冬蟲夏草菌有性發(fā)育及其相關(guān)基因的研究等方面。特別對(duì)于冬蟲夏草菌有性發(fā)育及其相關(guān)基因的研究一直是近年來國(guó)內(nèi)為研究的熱點(diǎn)。2、研究背景

由于冬蟲夏草菌特殊的生境和本身的復(fù)雜性導(dǎo)致對(duì)其系統(tǒng)全面的研究面臨困難，因而讓其在人工條件下長(zhǎng)出子座遇到巨大的挑戰(zhàn)，況且到底哪種或哪幾種菌是其正確的無性型學(xué)界眾說風(fēng)云。因此對(duì)于冬蟲夏草子座有性發(fā)育的研究一般都停留在天然冬蟲夏草的研究。冬蟲夏草菌能夠長(zhǎng)出子座完成有性生殖過程說明它的基因組中的某些基因一定發(fā)生著時(shí)空表達(dá)，到底是某些基因的表達(dá)量的變化引起了有性生殖還是冬蟲夏草菌生長(zhǎng)到某一個(gè)階段后一些基因在時(shí)間或空間的誘導(dǎo)下突然表達(dá)亦或是二者共同作用；這一有性發(fā)育過程中受到哪些因素的影響以及怎樣的影響到目前都沒有確定的答案。3、目的和意義通過對(duì)冬蟲夏草子座發(fā)育前后轉(zhuǎn)錄組基因文庫(kù)的表達(dá)差異研究旨在：（1）構(gòu)建冬蟲夏草長(zhǎng)出子座的實(shí)驗(yàn)體系；（2）從分子層面揭示冬蟲夏草子座發(fā)育的原因；（3）用生物信息學(xué)的方式預(yù)測(cè)冬蟲夏草有性生殖的關(guān)鍵基因；（4）發(fā)掘冬蟲夏草有性發(fā)育過程中未注釋的基因區(qū)和新的轉(zhuǎn)錄本；（5）通過對(duì)子座發(fā)育前后差異表達(dá)基因以及轉(zhuǎn)錄本的功能注釋和功能富集分析，為后續(xù)的生物信息學(xué)研究提供分子水平的依據(jù)。4、實(shí)驗(yàn)流程冬蟲夏草菌的活化

批量接種菌種營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)處理組：低溫誘導(dǎo)使其進(jìn)入子實(shí)體發(fā)育階段末端修復(fù)、3’端加Poly（A）連接接頭取樣樣品總RNA的提取及純度檢測(cè)對(duì)照組：保持營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)SMARTcDNALibraryConstructionKit試劑盒構(gòu)建cDNA文庫(kù)PCR富集文庫(kù)質(zhì)控上機(jī)測(cè)序獲得原始測(cè)序數(shù)據(jù)4.1、樣品培養(yǎng)和獲取將保藏的以前長(zhǎng)出過子座的菌種經(jīng)活化后重新接種到錐形瓶在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)過2-3個(gè)月開始低溫誘導(dǎo)使其長(zhǎng)出子座。在無菌環(huán)境中以子實(shí)體發(fā)育啟動(dòng)前正常營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的菌落和萌發(fā)一周左右的子實(shí)體原基作為對(duì)照組，用手術(shù)刀小心切取菌落。各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。4.2、提取總RNA用RNA提取試劑盒提取TotalRNA，并進(jìn)行樣品的純度、濃度和完整性檢測(cè)，以保證使用合格的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。4、實(shí)驗(yàn)流程4.3、

mRNA的富集以及cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

將上述檢測(cè)合格后的總RNA用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，接著以mRNA為模板用SMARTcDNALibraryConstructionKit試劑盒構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫(kù)，并進(jìn)行末端修復(fù)、3’端加Poly（A）和加上連接接頭，然后將cDNA文庫(kù)進(jìn)行PCR富集，最后通過QIAquickPCRPurificationKit試劑盒純化純化PCR產(chǎn)物，取一部分保存到-80℃保藏。

文庫(kù)構(gòu)建完成后，分別使用Qubit2.0和Agilent2100對(duì)文庫(kù)的濃度和InsertSize進(jìn)行檢測(cè)，使用Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。4、實(shí)驗(yàn)流程4.4、上機(jī)測(cè)序庫(kù)檢合格后，用HiSeq2500進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為PE100。最后獲得轉(zhuǎn)錄組的原始數(shù)據(jù)（RawData），每個(gè)測(cè)序樣品的RawData包括兩個(gè)FASTQ文件，分別包含所有cDNA片段兩端測(cè)定的Reads。4、實(shí)驗(yàn)流程

對(duì)RawData進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，去除其中的接頭序列及低質(zhì)量reads獲得高質(zhì)量的CleanData。

將CleanData與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，獲得MappedData?；贛appedData，進(jìn)行插入片段長(zhǎng)度檢驗(yàn)、隨機(jī)性檢驗(yàn)等測(cè)序文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估；進(jìn)行表達(dá)量分析、可變剪接分析、新基因發(fā)掘和基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化等基礎(chǔ)分析。根據(jù)基因在不同樣品或不同樣品組中的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析、差異表達(dá)基因功能注釋和功能富集等高級(jí)分析。5、生物信息學(xué)分析測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與玉米赤霉基因組比對(duì)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估差異表達(dá)基因富集分析（GO、KEEG富集分析）基因表達(dá)量分析表達(dá)大差異分析基因結(jié)構(gòu)分析差異表達(dá)基因注釋生物信息學(xué)分析流程圖新基因分析差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析差異表達(dá)基因功能注釋（GO、COG、KEEG）重復(fù)相關(guān)性分析差異表達(dá)基因聚類分析差異表達(dá)基因篩選可變剪接預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化SNP分析6、預(yù)期成果建立在人工培養(yǎng)基上長(zhǎng)出冬蟲夏草子座的實(shí)驗(yàn)體系；對(duì)冬蟲夏草子座發(fā)育前后的轉(zhuǎn)錄組基因文庫(kù)分別進(jìn)行測(cè)序；運(yùn)用生物信息學(xué)對(duì)上述所得數(shù)據(jù)進(jìn)行深度分析；找到冬蟲夏草子座發(fā)育前后轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)差異以及子座發(fā)育的啟動(dòng)基因；運(yùn)用生物信息學(xué)對(duì)冬蟲夏草子座啟動(dòng)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測(cè)；發(fā)表1-2篇學(xué)術(shù)論文；完成學(xué)位論文。7、進(jìn)度安排2015.08-2015.10查閱文獻(xiàn)和書籍2015.10-2015.11菌種活化和培養(yǎng)撰寫開題報(bào)告2015.12-2016.01提取子實(shí)體發(fā)育啟動(dòng)前正常營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)菌落的mRNA并送

基因公司進(jìn)行高通量測(cè)序2016.02-2016.04提取子實(shí)體原基發(fā)育期的mRNA并送基因公司高通量測(cè)序2016.05-2016.08獲得兩次樣品的序列數(shù)據(jù)2016.9-2016.12對(duì)測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行深度的生物信息學(xué)挖掘2017.1-2017.3撰寫學(xué)位論文8、可行性分析

本實(shí)驗(yàn)所用到的測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)方法比較成熟，前人已經(jīng)做過大量野生冬蟲夏草菌和其他物種的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和生物信息學(xué)分析；前人在其他真菌子實(shí)體發(fā)育機(jī)制的研究取得了一定進(jìn)