核酸的研究方法

關(guān)于核酸的研究方法第1頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月一.核酸的分離，提純和定量測定（一）DNA的分離提純真核生物DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合物（DNP）溶于水和濃鹽溶液，但不溶于0.14mol/L鹽溶液，用苯酚或氯仿使蛋白質(zhì)變性，DNA溶于上清液。在十二烷基硫酸鈉（SDS）存在下用蛋白酶消化細(xì)胞，再用苯酚和氯仿除去蛋白酶，用RNase除去RNA，操作在低溫下進(jìn)行，防止過酸，過堿，或機(jī)械振蕩，可得高質(zhì)量的DNA。第2頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

（二）RNA的分離提純RNA易被廣泛存在的RNase水解，所有器皿與溶液都要經(jīng)過處理除去RNase，在破碎細(xì)胞的同時(shí)應(yīng)使RNaes失活，在實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系中要加RNaes的抑制劑。目前常用的分離方法——為釽鹽/氯化銫密度梯度離心（RNA密度>1.89，DNA密度-1.71，蛋白質(zhì)密度<1.33）。另一為酸性釽鹽/酚/氯仿法。第3頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

（三）核酸含量的測定法利用堿基，糖和磷酸基進(jìn)行測定。紫外分光光度法：利用堿基260nm紫外吸收測定核酸含量。定磷法（鉬藍(lán)比色）：濃硫酸水解核酸之磷酸，酸性條件下磷酸與鉬酸形成磷鉬酸，用還原劑還原磷鉬酸為鉬藍(lán)，660nm比色測定含量。定糖法

RNA：核糖與鹽酸共熱生成糖醛，然后與地衣酚生成鮮綠色化合物，670nm比色測定含量。

DNA：脫氧核糖與二苯胺共熱生成藍(lán)色化合物，595nm比色測定含量。第4頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

生物組織冷的稀酸抽提

酸溶性物質(zhì)殘留物有機(jī)溶劑抽提脂類物質(zhì)殘留物

堿法熱酸法冷酸法堿降解再酸化熱酸提取冷酸提取酸提取液殘留物殘留物酸抽提液殘留物酸提取液

（RNA）（DNA）（RNA+DNA）

熱酸（RNA）提取殘留物酸提取液

（DNA）第5頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月(1)熱酸法把組織預(yù)處理后的沉淀部分用稀的過氯酸（PCA）或三氯乙酸（TCA）在90C處理15min，兩種核酸皆成為酸溶性物質(zhì)而抽提出來，并與大部分不溶性的蛋白質(zhì)分開。

優(yōu)點(diǎn)：無蛋白質(zhì)干擾，迅速簡單缺點(diǎn)：沒有把DNA與RNA分開，準(zhǔn)確度較差(2)冷酸法經(jīng)酸和有機(jī)溶劑處理后用1mol/LPCA于4C處理18h抽提出RNA，再用0.5NPCA在70C處理20min抽提出DNA。各抽提液用定磷法，定糖法或紫外分光光度法來測定。

優(yōu)點(diǎn)：可測定微量缺點(diǎn)：可能部分DNA混雜于RNA中第6頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）堿法

將酸不溶的非脂類含磷化合物與1N氫氧化鈉在37C保溫過夜，RNA被堿解為酸溶性核苷酸，而DNA不被分解。加入PCA或TCA酸化后，DNA即沉淀下來，上清液中為RNA的酸解產(chǎn)物。優(yōu)點(diǎn)：將DNA和RNA分開缺點(diǎn)：RNA部分還有其他含磷化合物第7頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

二.核酸的超速離心當(dāng)含有細(xì)小顆粒的懸浮液靜置不動(dòng)時(shí)，由于重力場的作用使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液體小的粒子就會(huì)上浮。物質(zhì)在介質(zhì)中沉降時(shí)還伴隨有擴(kuò)散現(xiàn)象。1)擴(kuò)散是無條件的絕對的。擴(kuò)散與物質(zhì)的質(zhì)量成反比，顆粒越小擴(kuò)散越嚴(yán)重。2)沉降是相對的，有條件的，要受到外力才能運(yùn)動(dòng)。沉降與物體重量成正比，顆粒越大沉降越快。顆粒越小沉降越慢，而擴(kuò)散現(xiàn)象則越嚴(yán)重。3)利用離心機(jī)產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，才能迫使這些微?？朔U(kuò)散產(chǎn)生沉降運(yùn)動(dòng)。離心就是利用離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速度旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的強(qiáng)大的離心力，加快液體中顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)和浮力密度的物質(zhì)分離開。第8頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月超速離心機(jī)第9頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

密度梯度沉降平衡法1.核酸密度的測定當(dāng)DNA樣品的沉降速度與擴(kuò)散速度達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，DNA形成一穩(wěn)定的區(qū)帶，漂浮于氯化銫密度梯度中的一定位置上。此時(shí)DNA所處的位置上的氯化銫密度等于DNA的浮力密度。用1-2個(gè)已知浮力密度的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品作參考，與未知樣品一起離心。2.測定DNA中G-C之含量G-C堿基對比A-T堿基對之密度大，含G-C對多的DNA，浮力密度大。而且G-C的百分含量與DNA的浮力密度之間呈正比關(guān)系。第10頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月3.溶液中核酸構(gòu)象的研究4.用于核酸的制備對于拓?fù)洚悩?gòu)體（核苷酸數(shù)目相同的核酸），其沉降速度為：

RNA>超螺旋DNA>解鏈環(huán)狀DNA>

松弛環(huán)狀DNA>線形DNA

也就是在離心管中最上層是線形DNA，最下面是RNA。

第11頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月三.核酸的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳以瓊脂糖為支持物。電泳的遷移率決定于以下因素：（1）核酸分子大小應(yīng)用凝膠電泳可正確地測定DNA片段的分子大小。在同一膠上加一已知其相對分子質(zhì)量的樣品。電泳完畢后，經(jīng)溴化乙錠染色，照相，從照片上比較待測樣品中的DNA片段與標(biāo)準(zhǔn)樣品中的哪一條帶最接近，即可推算出未知樣品中各片段的大小。（2）膠濃度（3）DNA的構(gòu)象（4）電壓（5）堿基組成（6）溫度（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳以聚丙烯酰胺作支持物。第12頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸的凝膠電泳第13頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）DNA的酶法測序四.核酸的核苷酸序列測定第14頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的酶法測序第15頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的酶法測序第16頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的酶法測序第17頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月Sanger法第18頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月Sanger法第19頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月第20頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

（二）DNA的化學(xué)法測序Maxam和Gilbert于1977年發(fā)明1）

用特異的化學(xué)試劑作用于不同的堿基進(jìn)行修飾2）

然后用哌啶切除堿基，DNA鏈斷裂成片段，末端為特異堿基3）

變性膠電泳分離，放射自顯影得到測序圖譜4）

判斷方法同Sanger終止法（三）RNA測序1）用特異酶切斷特異堿基位置的核酸鏈。電泳分離得到測序圖譜，同Sanger終止法。2）化學(xué)試劑斷裂RNA，電泳得到測序圖譜3）逆轉(zhuǎn)錄生成DNA，然后用DNA測序法。第21頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

五.DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

PCR,polymerasechainreaction是80年代發(fā)展起來的新技術(shù)，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)(molecularbiology)和基因工程(geneengineer-ing)及其它與DNA鑒定相關(guān)的其它領(lǐng)域，如疾病檢測、臨床應(yīng)用、商品檢疫、法醫(yī)鑒定和新藥品的開發(fā)等。PCR是指那些模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式在體外選擇性地?cái)U(kuò)增(amplify)DNA某個(gè)特殊區(qū)域的技術(shù)第22頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR過程在自然界是不存在的，它是人們對DNA復(fù)制的深刻理解而帶來的產(chǎn)物?，F(xiàn)代PCR概念是KaryMullis于20世紀(jì)80年代早期發(fā)明的。經(jīng)過與Cetus公司的同事合作，最終導(dǎo)致現(xiàn)在廣泛使用的PCR技術(shù)的誕生。Mullis的創(chuàng)新點(diǎn)在于使用兩個(gè)與DNA的兩條不同鏈互補(bǔ)的寡核苷酸作為引物特異性地?cái)U(kuò)增兩個(gè)引物之間的DNA區(qū)域，并且重復(fù)進(jìn)行。在此同時(shí)，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物又可作為下一輪擴(kuò)增的模板(template)，從而使得擴(kuò)增產(chǎn)物按幾何級數(shù)遞增。特別重要的是，從嗜熱細(xì)菌中分離的耐熱DAN聚合酶使PCR從概念成為真正適用的技術(shù)。第23頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月1.基本要素Template:ssDNAordsDNAPrimers:oligo-nucleotides等substrates:dNTPDNApolymerase:Taqpoly

2.反應(yīng)過程

denaturedsDNAssDNA92-96Cannealing37-72C50-58C

extension72C

這三個(gè)熱反應(yīng)過程的重復(fù)稱為一個(gè)循環(huán)(cycle)第24頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

PCR主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成：

即在高溫（95℃）下，待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；而后在低溫（37～55℃）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫（72℃）下，以引物3’端為合成的起點(diǎn)，以單核苷酸為原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過一次解鏈、退火、延伸三個(gè)步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復(fù)進(jìn)行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍，PCR產(chǎn)物得以2n的批數(shù)形式迅速擴(kuò)增，經(jīng)過25～30個(gè)循環(huán)后，理論上可使基因擴(kuò)增109倍以上，實(shí)際上一般可達(dá)106～107倍。第25頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第26頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月假設(shè)擴(kuò)增效率為“X”，循環(huán)數(shù)為“n”，則二者與擴(kuò)增倍數(shù)“y”的關(guān)系式可表示為：y=(1+X)n。擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)即n=30時(shí)，若X=100%，則y=230=1073741824(>109)；而若X=80%時(shí)，則y=1.830=45517159.6(>107)。由此可見，其擴(kuò)增的倍數(shù)是巨大的，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外線照射下（254nm）一般都可見到DNA的特異擴(kuò)增區(qū)帶。

第27頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月六.DNA的化學(xué)合成將待活化的核苷酸上的某些游離基團(tuán)保護(hù)（封閉）起來，使反應(yīng)按設(shè)計(jì)的方向進(jìn)行。5'-OH用二對甲氧三苯甲基（DMT）保護(hù)，堿基上的氨基用苯甲酸保護(hù)。對3'-OH用氨基亞磷酸化合物進(jìn)行活化。第28頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月A第一個(gè)核苷酸的3'-OH與固相（樹脂）結(jié)合在一起，它的5'-OH與活化的單體之間形成一個(gè)亞磷酸三酯，活化單體上的5'-OH及堿環(huán)上的氨基等由于受到保護(hù)而不會(huì)參與反應(yīng)。B亞磷酸三酯經(jīng)碘氧化形成磷酸