H5N1亞型禽流感病毒感染性克隆的構(gòu)建

匯報提綱：文獻綜述RNA干擾對A型流感病毒基因表達及病毒復(fù)制的抑制作用的研究H5N1亞型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004全基因組克隆、測序及其感染性克隆的構(gòu)建

目前一頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點1文獻綜述

文獻綜述目前二頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點禽流感的發(fā)生與流行

文獻綜述禽流感（AvianInfluenza,AI），是由A型流感病毒引起的一種禽類的烈性傳染性疾病或疾病綜合征。1878年，首次在意大利發(fā)現(xiàn)了禽流感的流行。高致病性禽流感（HighlyPathogenicAvianInfluenza,HPAI）是由A型流感病毒中H5、H7亞型流感病毒引起，目前已經(jīng)呈世界性分布，全世界50多個國家和地區(qū)（OIE數(shù)據(jù)）報道了高致病性禽流感的發(fā)生和流行。我國自1996年首次報道分離到H5N1亞型高致病性禽流感病毒之后，其流行一直呈上升趨勢。目前三頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點世界上高致病性禽流感感染人的發(fā)病與死亡情況（截至2006-6-03）

文獻綜述目前四頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點禽流感病毒的結(jié)構(gòu)模式圖

文獻綜述

流感病毒為單股負(fù)鏈RNA，由8個片斷組成，共編碼8種結(jié)構(gòu)蛋白和2種非結(jié)構(gòu)蛋白。其表面有一層由雙層脂質(zhì)構(gòu)成的囊膜，鑲嵌著二種重要的纖突，分別為HA、NA。病毒粒子的主要蛋白成分：?血凝素（HA）?神經(jīng)氨酸（NA）?核蛋白（NP）?基質(zhì)蛋白(M1,M2)?聚合酶（PB1、PB2、PA）?非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2）目前五頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點1995年康奈爾大學(xué)GuoSu博士試圖（1995）用反義RNA去阻斷秀麗新小桿線蟲（C.elegans）中的par1基因的表達時,意外發(fā)現(xiàn)給對照實驗組線蟲注射正義RNA，不但不增加該基因的表達，反而產(chǎn)生與反義RNA同樣的結(jié)果。1998年2月，華盛頓卡耐基研究院的Fire博士和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的Mello博士才證實GuoSu博士發(fā)現(xiàn)的正義RNA抑制基因表達的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄的RNA中污染了少量雙鏈RNA而引起。RNA干擾的歷史研究和發(fā)現(xiàn)過程

文獻綜述目前六頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點Fire和Mello實驗表明在線蟲消化道中注入雙鏈RNA不但可以阻斷整個線蟲的同源基因表達，還會導(dǎo)致其子一代的同源基因沉默。他們將這一現(xiàn)象首次稱為RNA干擾（RNAinterference，RNAi）。RNA干擾現(xiàn)象隨后在昆蟲、錐蟲、果蠅、渦蟲、斑馬魚、真菌、植物擬南芥等生物及哺乳動物細(xì)胞株中也分別被發(fā)現(xiàn)。RNA干擾的歷史研究和發(fā)現(xiàn)過程

文獻綜述目前七頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點RNA干擾的基本原理

文獻綜述ATP、RNA解旋酶目前八頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點通過作用于病毒特定基因的siRNA抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，siRNA可作用于細(xì)胞中病毒靶受體以干擾病毒的侵染，期望達到治療病毒性疾病的目標(biāo)。RNA干擾技術(shù)已經(jīng)在多種病毒研究中得到了成功的應(yīng)用：人類免疫缺陷病毒Ⅰ型、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、甲型流感病毒、口蹄疫病毒、西尼羅病毒和SARS冠狀病毒等。RNAi在病毒研究中的應(yīng)用

文獻綜述目前九頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點病毒的感染性克隆其實就是模擬病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等病毒生命周期，人工構(gòu)建病毒的過程。病毒的感染性克隆也稱為病毒的反向遺傳操作技術(shù)（ReverseGeneticManipulaton）。病毒的感染性克隆

文獻綜述目前十頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點反向遺傳學(xué)及其操作技術(shù)反向遺傳學(xué)是直接從生物的遺傳物質(zhì)入手來闡述生物生命發(fā)生的本質(zhì)現(xiàn)象，與之相關(guān)的各種技術(shù)統(tǒng)稱為反向遺傳學(xué)操作技術(shù)。病毒反向遺傳操作技術(shù)解決了對RNA病毒基因組難以操作這一困擾研究者多年的難題，開創(chuàng)了病毒研究的新時代。

文獻綜述目前十一頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點禽流感病毒的復(fù)制目前十二頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點以輔助流感病毒為基礎(chǔ)的反向遺傳操作系統(tǒng)核糖核蛋白轉(zhuǎn)染法RNA聚合酶Ⅰ方法完全以克隆的cDNA為基礎(chǔ)的反向遺傳操作系統(tǒng)RNA聚合酶Ⅰ系統(tǒng):17質(zhì)粒系統(tǒng)RNA聚合酶Ⅰ系統(tǒng):12質(zhì)粒系統(tǒng)雙向RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ轉(zhuǎn)錄系統(tǒng):8質(zhì)粒系統(tǒng)流感病毒反向遺傳操作技術(shù)的發(fā)展歷程

目前十三頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點以輔助流感病毒為基礎(chǔ)的反向遺傳操作系統(tǒng)

核糖核蛋白轉(zhuǎn)染法：

采用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，NS-CAT-NS，體外轉(zhuǎn)錄

RNA聚合酶Ⅰ方法：

RNA聚合酶I（polI）啟動子代替T7RNA聚合酶啟動子目前十四頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點完全以克隆的cDNA為基礎(chǔ)的反向遺傳操作系統(tǒng)

17質(zhì)粒系統(tǒng)

12質(zhì)粒系統(tǒng)

目前十五頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點2000年，Hoffmann等建立了RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ系統(tǒng)，vRNA和mRNA的合成來自于一個模板，不需要構(gòu)建專門的蛋白表達質(zhì)粒，為拯救病毒而構(gòu)建的質(zhì)粒數(shù)將大大減少。

這一系統(tǒng)采用共培養(yǎng)的293T細(xì)胞和MDCK細(xì)胞，8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，

RNA聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生負(fù)鏈vRNA，RNA聚合酶Ⅱ合成正鏈mRNA。轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒隨后將感染MDCK細(xì)胞并大量復(fù)制。RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ轉(zhuǎn)錄系統(tǒng):8質(zhì)粒系統(tǒng)目前十六頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ轉(zhuǎn)錄系統(tǒng):8質(zhì)粒系統(tǒng)目前十七頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點雙向RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ轉(zhuǎn)錄系統(tǒng):8質(zhì)粒系統(tǒng)目前十八頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點利用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)研究流感病毒的致病性利用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)研究流感病毒的生命周期利用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)研究流感疫苗流感病毒反向遺傳操作技術(shù)的應(yīng)用目前十九頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點“6＋2”流感疫苗目前二十頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點2RNA干擾對A型流感病毒基因表達及病毒

復(fù)制的抑制作用的研究

目前二十一頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點2.1研究目的和意義本研究選用NP和M2基因作為RNA干擾的靶基因，針對NP和M2基因保守區(qū)段設(shè)計了5對siRNA。研究了siRNA對基因表達的影響及其對H1N1、H5N1和H9N2亞型流感病毒在體內(nèi)和體外復(fù)制的影響，篩選出能有效抑制流感病毒復(fù)制的siRNA序列，為探索RNAi技術(shù)應(yīng)用于抗禽流感研究奠定基礎(chǔ)。

研究目的和意義目前二十二頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點2.2研究內(nèi)容禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004NP和M2基因的克隆及M2基因跨膜區(qū)的缺失(△M2).NP和△M2基因同eGFP共表達真核質(zhì)粒的構(gòu)建及其在HeLa細(xì)胞中的表達.NP和△M2基因特異性siRNA的設(shè)計及其真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建siRNA對NP和△M2基因在HeLa細(xì)胞中表達水平影響的研究.siRNA在體外（MDCK細(xì)胞上）對流感病毒(H5N1,H9N2,H1N1)復(fù)制的影響.siRNA的體內(nèi)試驗和攻毒保護試驗研究內(nèi)容目前二十三頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點2.3結(jié)果與分析目前二十四頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點NP基因的PCR擴增及同報告基因（EGFP）融合表達質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果與分析NP基因的PCR擴增結(jié)果質(zhì)粒pCDM-NP的酶切鑒定和PCR鑒定目前二十五頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點PCR方法缺失M2基因跨膜區(qū)結(jié)果與分析目前二十六頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點M2基因的克隆、跨膜區(qū)的缺失及同報告基因（EGFP）融合表達質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果與分析M2基因跨膜區(qū)缺失的PCR擴增結(jié)果質(zhì)粒pCDM-△M2的酶切鑒定和PCR鑒定目前二十七頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點結(jié)果與分析NP基因同EGFP在HeLa細(xì)胞中的融合表達△M2基因同EGFP在HeLa細(xì)胞中的融合表達質(zhì)粒pCDM-NP、pCDM-△M2在轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后12小時就可以檢測到特異性熒光，轉(zhuǎn)染后24小時發(fā)出熒光的細(xì)胞明顯增多，熒光主要呈彌散性分布于整個細(xì)胞中，說明NP基因與EGFP，△M2基因與EGFP均發(fā)生了融合表達。NP、△M2基因同報告基因（EGFP）在HeLa細(xì)胞中的融合表達目前二十八頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點NP和△M2基因特異性siRNA的設(shè)計及其真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建BamHI+HindIII結(jié)果與分析目前二十九頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點NP和△M2基因特異性siRNA真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建siRNA表達質(zhì)粒bamHI+HindIII的雙酶切鑒定M:DNAmarker(DL-15000)1:pSCMV-M482:pSCMV-M7543:pSCMV-M9494:pSCMV-NP7495:pSCMV-NP1383結(jié)果與分析目前三十頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點結(jié)果與分析siRNA表達質(zhì)粒與pCDM-NP共轉(zhuǎn)染

siRNA表達質(zhì)粒與pCDM-△M2共轉(zhuǎn)染siRNA表達質(zhì)粒與pCDM-NP或pCDM-△M2共轉(zhuǎn)染目前三十一頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點siRNA對NP和△M2基因在HeLa細(xì)胞中表達水平影響結(jié)果與分析目前三十二頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點siRNA表達質(zhì)粒同pCDM-NP共轉(zhuǎn)染后24h的流式細(xì)胞檢測結(jié)果與分析目前三十三頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點結(jié)果與分析siRNA表達質(zhì)粒同pCDM-△M2共轉(zhuǎn)染后24h的流式細(xì)胞檢測目前三十四頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點半定量RT-PCR檢測NP、EGFPmRNA的水平結(jié)果與分析A:pNP-EGFP+pS-NegativeB:pNP-EGFP+pS-NP749C:pNP-EGFP+pS-NP1383D:CellControl目前三十五頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點結(jié)果與分析A:p△M2-EGFP+pS-NegativeB:p△M2-EGFP+pS-M48C:p△M2-EGFP+pS-M754D:p△M2-EGFP+pS-M949E:CellControl半定量RT-PCR檢測△M2、EGFPmRNA的水平目前三十六頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點半定量RT-PCR檢測看家基因GAPDHmRNA的水平結(jié)果與分析A：pCDM-NP＋pSilencer4.1-negativeB：pCDM-NP＋pSCMV-NP749C：pCDM-NP＋pSCMV-NP1383D：pCDM-△M2＋pSilencer4.1-negativeE：pCDM-△M2＋pSCMV-M48F：pCDM-△M2＋pSCMV-M754G：pCDM-△M2＋pSCMV-M949H：CellControl目前三十七頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點Westernblot評價siRNA對目的基因表達的抑制作用結(jié)果與分析Westernblot檢測△M2基因的表達水平A：pCDM-△M2＋pSilencer4.1-negativeC：pCDM-△M2＋pSCMV-M754B：pCDM-△M2＋pSCMV-M949D：pCDM-△M2＋pSCMV-M48E：CellControl

Westernblot檢測NP基因的表達水平A：pCDM-NP＋pSilencer4.1-negativeC：pCDM-NP＋pSCMV-NP1383B：pCDM-NP＋pSCMV-NP749D：CellControl目前三十八頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點Westernblot檢測GAPDH基因的表達結(jié)果與分析A：pCDM-NP＋pSilencer4.1-negativeE：pCDM-△M2＋pSCMV-M48B：pCDM-NP＋pSCMV-NP749F：pCDM-△M2＋pSCMV-M754C：pCDM-NP＋pSCMV-NP1383G：pCDM-△M2＋pSCMV-M949D：pCDM-△M2＋pSilencer4.1-negativeH：CellControl目前三十九頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點siRNA對A型流感病毒在MDCK細(xì)胞中復(fù)制的抑制作用結(jié)果與分析在6孔板上培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，待細(xì)胞長至80%滿時分別轉(zhuǎn)染siRNA表達質(zhì)粒，同時設(shè)置pSilencer4.1-negative對照和空白細(xì)胞對照。轉(zhuǎn)染后18-24h分別接種流感病毒H1N1（106TCID50），H5N1（104TCID50），H9N2（106TCID50），接毒后48-72h收獲細(xì)胞及上清進行病毒TCID50的測定。目前四十頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點siRNA對A型流感病毒在MDCK細(xì)胞中復(fù)制的抑制作用結(jié)果與分析目前四十一頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點siRNA對A型禽流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用結(jié)果與分析各攻毒組小鼠（4只/組）注射質(zhì)粒的種類和劑量

目前四十二頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點siRNA對H5N1亞型禽流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用結(jié)果與分析

siRNA的瞬時表達特異性抑制H5N1亞型禽流感病毒在小鼠肺臟中的復(fù)制

目前四十三頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點siRNA對H5N1亞型禽流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用結(jié)果與分析

siRNA特異性抑制H5N1流感病毒在體內(nèi)的復(fù)制目前四十四頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點siRNA對H1N1和H9N2亞型流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用結(jié)果與分析siRNA的瞬時表達特異性抑制H1N1亞型流感病毒在小鼠肺臟中的復(fù)制siRNA的瞬時表達特異性抑制H9N2亞型禽流感病毒在小鼠肺臟中的復(fù)制

目前四十五頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點siRNA對H1N1和H9N2亞型流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用結(jié)果與分析

siRNA顯著性降低H1、H5和H9亞型流感病毒攻擊小鼠的肺病毒滴度目前四十六頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點siRNA對A型流感病毒攻擊小鼠的保護作用結(jié)果與分析攻毒保護組小鼠（8只/組）注射質(zhì)粒的種類和劑量

目前四十七頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點

siRNA對H1N1亞型流感病毒攻擊小鼠的保護作用結(jié)果與分析H1N1亞型流感病毒攻擊后小鼠體重的變化*,Groupsdifferforweightloss,p<0.05(Student’stest)

H1N1亞型流感病毒攻擊后小鼠的存活率

目前四十八頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點siRNA對H5N1亞型禽流感病毒攻擊小鼠的保護作用結(jié)果與分析H5N1亞型流感病毒攻擊后小鼠體重的變化*,Groupsdifferforweightloss,p<0.05(Student’stest)

H5N1亞型流感病毒攻擊后小鼠的存活率

目前四十九頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點2.4討論討論目前五十頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點RNAi的設(shè)計RNAi具有高度的基因特異性。在發(fā)夾式siRNA中，單個堿基的錯配都可能會消除它的RNAi效果。因此，構(gòu)建的siRNA表達質(zhì)粒必須經(jīng)過測序鑒定，保證與靶基因的100%同源性。所設(shè)計的siRNA序列不應(yīng)與人或其它動物基因組同源。本研究中，“看家基因”-GAPDH的檢測結(jié)果顯示：所選擇的siRNA沒有干擾轉(zhuǎn)染細(xì)胞本身的基因表達和轉(zhuǎn)錄。討論目前五十一頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點NP和M2基因作為RNA干擾的靶基因的意義

NP和M2基因是A型流感病毒中最保守的基因，變異很小，因而選擇NP和M2基因作為RNA干擾的靶基因，這樣找到的能有效抑制流感病毒復(fù)制的siRNA序列對所有A型流感病毒都是有效的。本研究的結(jié)果也顯示了，能有效抑制NP和M2基因轉(zhuǎn)錄和表達的siRNA對A型流感病毒中不同亞型的病毒均有抑制作用，說明以NP和M2為靶基因設(shè)計的siRNA對A型流感病毒的抑制作用具有廣譜性。討論目前五十二頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點RNA干擾在抗病毒研究中的應(yīng)用前景

依靠RNAi技術(shù)獲得病毒復(fù)制的強有效抑制的同時，不得不考慮病毒逃逸的可能性。為避免這個困難，通常采用多個必需靶位點作為聯(lián)合siRNA治療方法，以避免病毒逃逸突變株的演化。本研究中采用siRNAM-48+NP-1383聯(lián)合使用時的效果明顯優(yōu)于二者單獨使用時的效果，這可能也是因為聯(lián)合使用時針對的是流感病毒的兩個基因的靶位點，從而有效地減少了病毒逃逸的可能，增強了治療效果。討論目前五十三頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點2.5結(jié)論完成了禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004NP和M2基因的克隆，采用PCR方法缺失了M2基因跨膜區(qū)的第26－55位氨基酸（△M2）。

實現(xiàn)了NP和△M2基因分別同EGFP在HeLa細(xì)胞中的融合表達，融合蛋白呈彌散性分布于細(xì)胞漿中。以NP和△M2基因為靶序列，設(shè)計合成了五個siRNA，并構(gòu)建了各自的表達質(zhì)粒。將siRNA表達質(zhì)粒分別與對應(yīng)的pCDM-NP和pCDM-△M2共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，通過熒光觀察、流式細(xì)胞、半定量RT-PCR和Westernblot等方法檢測證實，針對NP基因設(shè)計的2個siRNA均對NP基因的轉(zhuǎn)錄和表達產(chǎn)生了顯著的抑制作用，針對△M2基因設(shè)計的3個siRNA也均對△M2基因的轉(zhuǎn)錄和表達產(chǎn)生了顯著的抑制作用。目前五十四頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點2.5結(jié)論設(shè)計的siRNA抑制流感病毒（H5N1，H9N2，H1N1）在MDCK細(xì)胞上的復(fù)制，其中pSCMV-M48和

pSCMV-NP1383對流感病毒復(fù)制的抑制作用最強。設(shè)計的siRNA導(dǎo)入小鼠體內(nèi)能有效降低H5N1，H9N2，H1N1流感病毒感染小鼠的肺病毒滴度，pSCMV-M48和

pSCMV-NP1383聯(lián)合使用時，攻毒小鼠體重減輕幅度較對照組小，且能部分保護小鼠遭受致死性流感病毒的攻擊。

目前五十五頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點3H5N1亞型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004

全基因組克隆、測序及其感染性克隆的構(gòu)建

目前五十六頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點

3.1研究目的和意義本研究針對2004年春禽流感爆發(fā)流行期間在湖北省家禽感染病料中分離出的一株H5N1禽流感病毒，對其全基因組進行克隆、測序及遺傳進化分析，根據(jù)基因核苷酸序列繪制出了H5N1亞型禽流感病毒基因組系統(tǒng)發(fā)育進化樹。目的是揭示H5N1禽流感病毒湖北分離株與其它流感病毒流行株間的親緣關(guān)系及遺傳演化規(guī)律，為高致病性禽流感的預(yù)測、監(jiān)控、防制提供有力的證據(jù)。研究目的和意義目前五十七頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點反向遺傳操作技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在，實現(xiàn)了使用完全以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的操作系統(tǒng)，因此可以對病毒基因組方便地操作，顯示了良好的應(yīng)用前景。病毒的反向遺傳操作技術(shù)在深入闡明病毒的生活周期和致病性、基因組的結(jié)構(gòu)與功能、研制基因修飾的疫苗候選株、發(fā)展病毒載體等方面可以廣泛地應(yīng)用。研究目的和意義目前五十八頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點3.2研究內(nèi)容H5N1亞型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004

全基因組克隆、測序及遺傳進化分析用于流感病毒拯救的八個轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒的構(gòu)建H5N1亞型禽流感病毒湖北分離株的體外拯救拯救病毒的鑒定研究內(nèi)容目前五十九頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點3.3結(jié)果與分析目前六十頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點基因組八個片段的PCR擴增結(jié)果目前六十一頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點H5N1亞型禽流感病毒基因序列及遺傳進化分析目前六十二頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點H5N1亞型禽流感病毒基因序列及遺傳進化分析目前六十三頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點H5N1亞型禽流感病毒基因序列及遺傳進化分析目前六十四頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點目前六十五頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點全基因組的亞克隆及八質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的構(gòu)建BsmBI&BsaI目前六十六頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點流感病毒的拯救SPF雞胚增殖目前六十七頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點拯救病毒在SPF雞胚中增殖不同代次的血凝價

結(jié)果與分析1,5：TheNO.1generationvirustiters2,6：TheNO.2generationvirustiters3,7：TheNO.3generationvirustiters4,8：Negativecontrol目前六十八頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點獲救病毒和野毒對MDCK細(xì)胞病變的比較結(jié)果與分析原始野毒在MDCK細(xì)胞上形成的病變拯救病毒在MDCK細(xì)胞上形成的病變正常的MDCK細(xì)胞對照目前六十九頁\總數(shù)七十六頁\編于十三點RT-PCR擴增鑒定拯救病毒結(jié)果與分析1DNAmarker(DL15000)2RT-PCRproductofPB2gene3RT-PCRproductofPB1gene4RT-PCRproductofPAgene5RT-PCRproductofHAgene6RT-PCRproductofNPgene7RT-PCRproductofNAgene8RT-PCRproductofMgene9RT-