上海市臨檢中心 二代測序NGS培訓(xùn)班 7-單蘭蘭-靶向測序Panel的在線設(shè)計定制

靶向測序Panel的在線設(shè)計定制單蘭蘭Illumina應(yīng)用培訓(xùn)師?

2017Illumina,

Inc.

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reserved.ForResearch

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diagnosticprocedures.課程目標●

明確定制靶向測序Panel的意義●

掌握使用DesignStudio設(shè)計定制AmpliSeq

For

IlluminaGene

Panel的流程●

了解使用DesignStudio設(shè)計定制Panel的注意點●

了解如何查看設(shè)計結(jié)果和優(yōu)化設(shè)計2ForResearch

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diagnosticprocedures.用于突變檢測的方法比較費用、覆蓋度、內(nèi)容和樣本通量/反應(yīng)圈的大小代表內(nèi)容邊緣線的粗細代表樣本通量/反應(yīng)更高的覆蓋度&覆蓋均勻性商品化的固定Panel自己設(shè)計定制的Panel更高價/樣本更低價/樣本W(wǎng)ESWGS更低的覆蓋度&覆蓋均勻性3如何訪問DesignStudio中國官網(wǎng)網(wǎng)頁

/4ForResearch

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diagnosticprocedures.用DesignStudio設(shè)計定制測序Panel5ForResearch

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diagnosticprocedures.Myillumina賬號6ForResearch

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diagnosticprocedures.DesignStudio主頁7ForResearch

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diagnosticprocedures.第一步

選擇實驗類型

Select

Assay8ForResearch

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diagnosticprocedures.實驗方法的選擇三種方法之間的比較技術(shù)描述AmpliSeqCustomDNADesignNextera

RapidCaptureCustom

EnrichmentTruSeqTargetedRNAExpression靶向區(qū)域：最大為5

Mb靶向區(qū)域：500

kb

–

15Mb最低起始量：50

ng用來做基因表達譜分析與驗證靶向區(qū)域可以在固定的panel里選，或者在此基礎(chǔ)上增加自己感興趣的區(qū)域每個pool最多可含有6144對引物含已設(shè)計好并有實驗驗證5000多個基因的引物池支持物種人、大鼠、小鼠、牛、雞、狗、田鼠、豬、綿羊、玉米、水稻、大豆、番茄人人、大鼠、小鼠儀器iSeq100MiniSeqMiSeqNextSeq550iSeq100MiniSeqMiSeqNextSeq550HiSeq3000/4000iSeq100MiniSeqMiSeqNextSeq550測序讀長最長：2x150

bp最長：2x150

bp最長：2x300

bp最長：2x150

bp最長：2x150bp最長：2x150bp最長：2x300

bp最長：2x150

bp最長：2x150bp最長：1x50bp最長：1x50

bp最長：1x50

bp最長：1x50

bp后續(xù)數(shù)據(jù)分析軟件本地：Local

RunManagerDNAAmplicon

AnalysisModule本地：Local

RunManagerDNAEnrichment本地：MiSeqReporterEnrichmentWorkflow云端：本地：Local

RunManagerTargeted

RNAAnalysis

Module本地：MiSeqReporterTargetedRNA云端：BaseSpaceTruSeqTargetedRNACoreAppBaseSpace

Isaac

&BWA

EnrichmentCore

Apps云端：BaseSpace

DNAAmplicon

CoreAppAnalysis

Module云端:WorkflowVariantStudioBaseSpaceIsaac

&BWAEnrichmentCore

Apps云端：BaseSpace

Variant

InterpreterBaseSpaceTruSeqTargetedRNACoreApp云端：BaseSpaceTruSeqNextBioResearch云端：BaseSpace

Issac&

BWATargetedRNACoreAppEnrichment

CoreAppsNextBioResearchNextBioResearch9實驗方法的選擇DNA為起始樣本AmpliSeq

GeneAmpliSeqHotspot靶向區(qū)域:靶向區(qū)域:1

Kb-5Mb1

Kb–

5Mb基因、外顯子、和/或染色體上的位置信息熱點區(qū)域和SNPAmpliSeqOn-DemandNexteraRapidCapture靶向區(qū)域：靶向區(qū)域:1Kb-5Mb人，已設(shè)計好，并通過實驗檢測過>

5Mb大的基因Panel和/或擴大外顯子區(qū)域10ForResearch

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diagnosticprocedures.AmpliSeq擴增引物設(shè)計Pool

1Pool

2Amplicon

CAmplicon

AAmplicon

B**?

整個基因?

熱點區(qū)域SNP

1SNP

2對整個基因區(qū)域設(shè)計(2組引物)僅對熱點區(qū)域設(shè)計(1組引物)??較大的基因靶向區(qū)域有更好的覆蓋度如果擴增產(chǎn)物之間有序列重疊區(qū)域，引物需要???像SNP這種比較小的靶向區(qū)域擴增產(chǎn)物之間沒有序列重疊區(qū)例如:

SNP1(Amplicon

A)SNP2(Amplicon

B)分開到兩個pool里?例如:

Pool

1

(Amplicons

A&B)Pool

2

(Amplicon

C)11ForResearch

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diagnosticprocedures.輸入設(shè)計的名字必須唯一且<

25個字符12ForResearch

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diagnosticprocedures.第二步

參數(shù)設(shè)置

Configure

Design13ForResearch

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diagnosticprocedures.參數(shù)設(shè)置樣本類型（Sample

Type）設(shè)置RegularFFPEcfDNA高質(zhì)量、完整的DNA福爾馬林固定包埋樣本游離細胞DNA(一般來自血液)一般長度大于幾kb通常為降解樣本，甚至嚴重降解短的、一般長度為Amplicon大小選擇:150

–

180bpAmplicon大小選擇:125

–

175bp125

-375bpAmplicon大小選擇:125-140bp14ForResearch

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diagnosticprocedures.參數(shù)設(shè)置擴增產(chǎn)物最大長度（Max

Amplicon

Length）設(shè)置采用較短擴增產(chǎn)物的好處?

對于FFPE/降解的DNA樣本比較合適?

所需的測序讀長較短，測序時間較短采用較長擴增產(chǎn)物的好處?

成本更低：覆蓋相同大小的靶向區(qū)域，使用較長的擴增產(chǎn)物所需的引物數(shù)量會更少?

設(shè)計引物時更加靈活，可減少未覆蓋區(qū)域（gaps）15ForResearch

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diagnosticprocedures.參數(shù)設(shè)置嚴格度（Stringency）的設(shè)置嚴格度的設(shè)置:?

為了控制擴增產(chǎn)物的特異性?

會影響擴增區(qū)域的選擇和引物的對數(shù)16ForResearch

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diagnosticprocedures.第三步

靶向區(qū)域設(shè)置

Manage

Targets通過基因名字來添加靶向區(qū)域17ForResearch

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diagnosticprocedures.靶向區(qū)域的選擇只是編碼區(qū)（CDS

Only）,

只是外顯子區(qū)（Exon

Only）或者整個基因區(qū)域CodingExonCodingExonCodingExon5’

UTR3’

UTRIntronIntronCDSOnlyExon

OnlyFull

Region只是對編碼區(qū)進行設(shè)計（CDS

Only）–

以編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域

(不包括5’或3’的UTR)為靶向區(qū)域只是對外顯子區(qū)進行設(shè)計（Exon

Only）–

以所有外顯子區(qū)域

(包括5’或3’的UTR的序列）為靶向區(qū)域整個基因區(qū)域(只有通過基因所在染色體的起始/終止位置來添加)–

包括一些有重復(fù)序列的內(nèi)含子區(qū)域–

由于一些無法覆蓋的區(qū)域（gaps）的存在，會導(dǎo)致coverage

%較低18ForResearch

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diagnosticprocedures.靶向區(qū)域設(shè)置設(shè)置靶向基因往兩端擴展的堿基數(shù)Exon

padding的設(shè)置可以增加intron-exon交接區(qū)域作為靶向區(qū)域Exon

padding的設(shè)置即為引物設(shè)計增加了靶向基因兩邊的堿基數(shù)19ForResearch

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diagnosticprocedures.靶向區(qū)域設(shè)置

Manage

Targets通過給出染色體上的位置信息來添加靶向區(qū)域最多20個數(shù)字或字母?

Chromosome里輸入：chr緊跟數(shù)字（chr這三個字母大小寫均可）?

必須輸入Chromosome、Start、Stop的信息?

Start和Stop之間最大差為100,000

bp20ForResearch

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diagnosticprocedures.靶向區(qū)域設(shè)置

Manage

Targets通過按模板創(chuàng)建文本來批量添加靶向區(qū)域(.csv或.bed)1.

按格式下載相應(yīng)模板2.

點擊Select

aFile3.

選擇編輯好的.csv或.bed格式4.

點擊Upload

File批量添加靶向區(qū)域21ForResearch

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diagnosticprocedures.第四步

提交進行在線設(shè)計22ForResearch

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diagnosticprocedures.第五步

查看在線設(shè)計結(jié)果（進行狀態(tài)）設(shè)計時間可能會很久，可關(guān)閉此網(wǎng)頁23ForResearch

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diagnosticprocedures.第五步

查看在線設(shè)計結(jié)果（設(shè)計完成）會收到系統(tǒng)提示設(shè)計已完成的郵件24ForResearch

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diagnosticprocedures.覆蓋度百分比

Percentage

Coverage25ForResearch

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diagnosticprocedures.設(shè)計結(jié)束后給出的4-6個文件文件名稱Submitted.bed內(nèi)容.bed格式靶向區(qū)域所在染色體上的位置信息，.bed引物設(shè)計和擴增子靶向區(qū)域所在染色體上的位置信息，格式Designed.bed沒有設(shè)計的或者沒有覆蓋到的區(qū)域所在染色體上的位置信.bedMissed.bedmanifest.txt息，上下游引物的序列，靶向區(qū)域所在染色體上的位置信息和序.txt格式列信息，格式只有通過輸入‘基因名’形式進行設(shè)計結(jié)束后，會提供靶向區(qū)域具體被覆蓋的情況coverage_details.csv-包含靶向區(qū)域所在染色體上的位置信息，靶向區(qū)域總的堿基數(shù)、設(shè)計的擴增子的數(shù)量、被覆蓋的堿基數(shù)和被覆蓋的百分比統(tǒng)計文件包含:coverage_summary.csv

-被覆蓋的堿基數(shù)、總體的覆蓋度、每個基因和區(qū)域所涉及的外顯子個數(shù)*.bed格式文件可以用IGV或UCSC來查看26ForResearch

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diagnosticprocedures.DesignStudio里的UCSC的鏈接選擇Region用IE瀏覽器訪問UCSC鏈接27For

Research

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indiagnostic

procedures.第六步

確認最終設(shè)計結(jié)果和獲得報價（完成）28ForResearch

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diagnosticprocedures.設(shè)計結(jié)果展示——案例分析●

四種不同靶向區(qū)域類型:案例一案例二394delTT突變位點852del22突變位點CFTR基因里以CFTR基因里2

bp的缺失位點為靶向區(qū)域20

bp的缺失位點為靶向區(qū)域案例三案例四CEBPA基因PIK3CA基因含高GC含量的靶向區(qū)域含假基因序列的靶向區(qū)域29ForResearch

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diagnosticprocedures.案例

1:

小的Indel（2

bp）點擊DesignStudio里的UCSC的鏈接進行查看UCSCTracksSubmittedDesignedMissedCFTR基因的394delTT突變位點(2

bp缺失)Chr7:117149185-117149186您定制的panel沒有覆蓋到的區(qū)域您定制的panel所覆蓋的區(qū)域30ForResearch

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diagnosticprocedures.案例

2:

小的Indel（20

bp）點擊DesignStudio里的UCSC的鏈接進行查看CFTR基因的852del22突變位點(20

bp缺失)：Chr7:117175442-117175463TargetsDesignedMissed31ForResearch

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diagnosticprocedures.案例

3:

高GC含量的區(qū)域點擊DesignStudio里的UCSC的鏈接進行查看CEBPA基因，靶向區(qū)域位置信息:

Chr19:33792243-33793320TargetsDesignedMissed32ForResearch

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diagnosticprocedures.思考題：CEBPA基因區(qū)域都被覆蓋了嗎?沒有完全覆蓋●

設(shè)計的技巧和優(yōu)化策略:-

高GC含量區(qū)域(>70-80%):.

一般來說是很難做引物設(shè)計的區(qū)域.

通過只對編碼區(qū)進行設(shè)計（選擇CDS

only

）可能會有所幫助.

通過選擇較長的擴增子長度對引物設(shè)計可能會有所幫助(有更多的空間來設(shè)計引物).

通過選擇較低的嚴格度可能會有所幫助33ForResearch

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diagnosticprocedures.案例

4:

具有假基因的區(qū)域點擊DesignStudio里的UCSC的鏈接進行查看PIK3CA基因：Chr3:178936074-178936095TargetsDesignedMissed34ForResearch

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diagnosticprocedures.思考題：PIK3CA基因區(qū)域都被覆蓋了嗎?是的…但是…●

您如何知道是否存在假基因?-

在里搜索●

設(shè)計技巧和策略:-

假基因:.

如果已知是，那么可以升級到Concierge高級設(shè)計服務(wù)35ForResearch

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diagnosticprocedures.引物設(shè)計所遵循的規(guī)則為什么有時候DesignStudio設(shè)計的引物不能覆蓋所有的區(qū)域用于多重PCR的引物必須有相同的融解溫度（Tm，相似的長度和GC含量）在引物結(jié)合位點沒有長的多聚體結(jié)構(gòu)引物結(jié)合位點的GC含量必須在20-80%靶向區(qū)域必須不能與已知的重復(fù)序列區(qū)域有多于30%的重疊序列區(qū)域36ForResearch

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diagnosticprocedures.較難進行引物設(shè)計的區(qū)域靶向區(qū)域類型描述可能影響到后續(xù)分析設(shè)計indel較大的(>50

bp)50

bp大于的插入缺失區(qū)域GC比較高的

含量GC較高的

含量會抑制擴增