上海市臨檢中心 PCR人員上崗培訓(xùn)班 課件4、2016PCR培訓(xùn)班課件-王雪亮

分子診斷質(zhì)控品的特性、選擇和應(yīng)用1涉及疾病種類2分子診斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的現(xiàn)狀Gene

Reviews：截止2013年05月，已發(fā)現(xiàn)3007種基因疾病，其中2776種已經(jīng)進(jìn)入臨床檢測(cè)，231種仍在研究階段，目前全球已有618個(gè)有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)工作3臨床實(shí)驗(yàn)室如何來(lái)保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠？4專家指出采用已知弱陽(yáng)性和陰性質(zhì)控品進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制是保證檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其監(jiān)控的是實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的最重要的性能指標(biāo)，即重復(fù)性，并決定了當(dāng)批實(shí)驗(yàn)測(cè)定是否有效，報(bào)告能否發(fā)出，是對(duì)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的即時(shí)性評(píng)價(jià)。李金明等，涉及基因擴(kuò)增的個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證的重要性,

2012,35(11),963-9665質(zhì)

控

品定義：用于體外診斷的質(zhì)量控制物質(zhì)，是一種旨在用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)中使用的物質(zhì)、材料等。目的：是評(píng)價(jià)或驗(yàn)證測(cè)量精密度或由于試劑或分析儀器的變化導(dǎo)致的分析偏差等。用途：用于室內(nèi)質(zhì)量控制、室間質(zhì)量評(píng)價(jià)等。6質(zhì)控品的種類?

根據(jù)有無(wú)測(cè)定值可分為定值質(zhì)控品和非定值質(zhì)控品。?

根據(jù)質(zhì)控品的物理性狀不同分為凍干質(zhì)控品和液體質(zhì)控品。7常用質(zhì)控品類型?

臨床樣本?

細(xì)胞系?

人工制備樣本

質(zhì)粒

轉(zhuǎn)錄RNA

假病毒顆粒8臨

床

樣

本9臨

床

樣

本優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：?

真實(shí)樣本?來(lái)源有限?

評(píng)價(jià)整個(gè)分析過程

??

包含所需基因序列

?最優(yōu)樣本生物傳染性可能存在異質(zhì)性10細(xì)

胞

系Meissner

JD,

JGen

Virol.1999Jul;80(Pt7):1725-33.細(xì)

胞

系缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：?

穩(wěn)定性較差?

模擬真實(shí)樣本，穩(wěn)定性好?

細(xì)胞株有限?

評(píng)價(jià)整個(gè)分析過程?

生物安全性實(shí)用樣本?

易于制備，成本低12人工合成樣本——質(zhì)粒13人工合成樣本——質(zhì)粒優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：?

明確的基因序列?

易于生產(chǎn)，價(jià)格便宜?

具有再生性?非“真實(shí)”樣本?不能監(jiān)測(cè)提取過程?

無(wú)感染性?

材料穩(wěn)定性好14人工合成樣本——體外轉(zhuǎn)錄RNAChangMet

al,

JClin

Virol.

2012,

55(2):128-33.人工合成樣本——體外轉(zhuǎn)錄RNA優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：?

明確的基因序列?

穩(wěn)定性差?

具有再生性?

無(wú)感染性?

不能監(jiān)測(cè)提取過程16人工合成樣本——假病毒顆粒Pasloske

BL

et

al.,JClinMicrobiol.

1998

Dec;

36(12):3590-4.人工合成樣本——假病毒顆粒優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：?

明確的基因序列?

監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過程?

生物安全性?

專利保護(hù)，價(jià)格昂貴?

表面結(jié)構(gòu)不同，不能充分模擬真實(shí)病毒?

穩(wěn)定性好18目前現(xiàn)狀？?

分子診斷項(xiàng)目快速增長(zhǎng)?

新的技術(shù)發(fā)展（如NGS、數(shù)字PCR等）引入新的檢測(cè)項(xiàng)目但是……對(duì)于絕大多數(shù)分子診斷項(xiàng)目，現(xiàn)在還不能提供陽(yáng)性質(zhì)控品（經(jīng)過確認(rèn)的更是少之又少?。?9官方機(jī)構(gòu)-WHO/官

方

機(jī)

構(gòu)——其他American

Type

Culture

Collection/Coriell

CellRepositories/European

Collection

ofCellCultures.uk/German

Collection

ofMicroorganisms

and

Cell

Cultureshttps://www.dsmz.de/Japanese

Collection

ofResearchBioresourceshttp://cellbank.nibiohn.go.jp/english/RikenBioresource

Centerhttp://en.brc.riken.jp/21專家指出盡管少部分分子檢測(cè)項(xiàng)目已有質(zhì)控物質(zhì)，但是大部分的分子檢測(cè)項(xiàng)目還是缺乏有效的質(zhì)控物質(zhì)。其次，現(xiàn)在的多元質(zhì)控物質(zhì)商品的開發(fā)也不夠成熟。實(shí)驗(yàn)室更愿使用免費(fèi)的患者標(biāo)本或者根本不進(jìn)行質(zhì)量控制，只有罕見突變才勉強(qiáng)花錢購(gòu)買質(zhì)控品。王治國(guó)等，分子診斷質(zhì)量控制面臨的問題，2012，6(30)，466-467022質(zhì)控品的使用?

已知陽(yáng)性質(zhì)控?

已知陰性質(zhì)控?

空白（無(wú)模板）23Baseman

JG,etal.JClin

Virol

2005,32S;16-24.陽(yáng)性質(zhì)控品?

定性檢測(cè)

接近方法測(cè)定下限濃度?

定量檢測(cè)

測(cè)定線性范圍內(nèi)的高、中、低濃度24陰性質(zhì)控品?

監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室以前擴(kuò)增產(chǎn)物的污染?

實(shí)驗(yàn)操作所致樣本間的交叉污染?

試劑污染25空白管質(zhì)控?

監(jiān)測(cè)擴(kuò)增試劑是否發(fā)生污染，具有較強(qiáng)的污染鑒別性?

監(jiān)測(cè)反應(yīng)液加樣區(qū)及加樣過程是否發(fā)生污染?

鑒別實(shí)驗(yàn)室是否發(fā)生污染26質(zhì)控品使用的注意事項(xiàng)?

均勻分散于臨床標(biāo)本中，與臨床標(biāo)本同時(shí)處理?

擴(kuò)增時(shí)不應(yīng)將質(zhì)控品放于固定孔中，放置位置應(yīng)順延以便監(jiān)測(cè)每孔的擴(kuò)增效率?

質(zhì)控品雖經(jīng)滅活處理，但仍具有潛在的傳染性，仍應(yīng)按傳染性樣本對(duì)待，注意防護(hù)措施?

注意質(zhì)控品最佳保存條件，使用完畢后應(yīng)及時(shí)放回冷藏室，如發(fā)生下述情況嚴(yán)禁使用

已過有效期

樣品管已發(fā)生泄漏

樣品管標(biāo)記無(wú)法識(shí)別27質(zhì)控品使用的局限性?

無(wú)法對(duì)提供虛假結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行質(zhì)量保證，不標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用檢測(cè)方法與試劑也是不能進(jìn)行評(píng)價(jià)的。?

因各種原因造成的常規(guī)試劑變化（如：過期、污染等問題），儀器設(shè)備或者操作技術(shù)的缺陷，也無(wú)法進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)。?

當(dāng)任何質(zhì)量控制測(cè)試的結(jié)果未能達(dá)到期望值時(shí)，應(yīng)對(duì)失控原因進(jìn)行分析。28失控分析?

實(shí)驗(yàn)操作人員在檢測(cè)樣本時(shí)，如發(fā)現(xiàn)質(zhì)控檢測(cè)數(shù)據(jù)不符合質(zhì)控規(guī)則，應(yīng)在室內(nèi)質(zhì)控記錄單上簡(jiǎn)述失控原因。?

失控的原因主要包括：操作失誤、質(zhì)控品失效、儀器維護(hù)不良以及質(zhì)控測(cè)定不當(dāng)?shù)取?9失控分析?

操作失誤——主要是人為因素

加樣問題（漏加、錯(cuò)加等）

試劑及樣本識(shí)別

誤讀誤判

個(gè)人操作問題（如：加樣不準(zhǔn)、離心條件、操作不標(biāo)準(zhǔn)等）30失控分析?

質(zhì)控品失效質(zhì)控品過期保存不當(dāng)，如冷凍樣本冷藏保存，造成核酸降解操作或意外污染：手工加樣過程中交叉污染或加錯(cuò)樣。31失控分析?

儀器設(shè)備等：

PCR儀、離心機(jī)、加樣器、恒溫設(shè)備等應(yīng)建立技術(shù)檔案，應(yīng)定期進(jìn)行校準(zhǔn)維護(hù)開機(jī)檢查，查看前一工作日實(shí)驗(yàn)檢測(cè)報(bào)告及維護(hù)記錄常用耗材：吸頭、離心管等32失控后處理?

重新測(cè)定同一質(zhì)控品，應(yīng)確認(rèn)以下情況：室內(nèi)質(zhì)控品是否被污染或減少檢測(cè)試劑是否被污染或減少儀器、設(shè)備、耗材的應(yīng)用情況是否出現(xiàn)異常查明是否有人為誤差，另外還可以查出偶然誤差，即重測(cè)的結(jié)果在允許范圍內(nèi)（在控）。如果重測(cè)的結(jié)果不在允許范圍內(nèi)，則可以進(jìn)行下一步操作。33失控后處理?

新開一瓶質(zhì)控品，重新測(cè)定失控項(xiàng)目?

主要目的：如果結(jié)果正常，說(shuō)明原來(lái)質(zhì)控品可能過期或在室溫放置時(shí)間過長(zhǎng)而變質(zhì)，或者被污染。如果仍然不在允許范圍，則進(jìn)行下一步。34失控后處理?

維護(hù)儀器，重測(cè)失控項(xiàng)目，應(yīng)確認(rèn)以下問題懷疑試劑問題儀器存在不穩(wěn)定情況（以往或近期）主要目的：檢查儀器狀態(tài)，運(yùn)行條件是否被更改。檢查試劑，此時(shí)可更換試劑以查明原因。如結(jié)果仍不在允許范圍，則進(jìn)行下一步。35失控后處理?

確認(rèn)正確應(yīng)用以上步驟都未能得到在控結(jié)果，那就有可能是儀器的潛在問題或試劑的特殊原因，應(yīng)上報(bào)質(zhì)量主管、主任。?

對(duì)多次的質(zhì)控失敗查找原因，確認(rèn)消除后才能開展正常檢測(cè)工作。36陰性樣本做出陽(yáng)性結(jié)果？主要考慮：?

污染問題，如試劑污染、質(zhì)控品污染、儀器管路污染、試驗(yàn)耗材試管、滴管污染、操作污染等；?

質(zhì)