南寧無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(NIPT)會議課件 NIPT檢測流程和常見問題分析

NIPT檢測流程和常見問題分析廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司王陽NGS技術(shù)經(jīng)理C目

錄ONTENT1

NIPT的科學(xué)和技術(shù)基礎(chǔ)2

NIPT檢測流程3

常見問題NIPT檢測流程和常見問題分析NIPT的科學(xué)基礎(chǔ)

–血漿游離胎盤DNA?

以穩(wěn)定的核小體形式?

含量隨孕周增大而增加250002000015000100005000060%平均含量11.3%50%40%30%20%10%0%12胎盤來源母體外周血含有的cffDNA，幾乎全部來源于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞。050100150200250100200?

半衰期短，產(chǎn)后2小時后消失Case1Case

2Case檢出時限懷孕4周可檢出，8周后含量上升并穩(wěn)定存在。達(dá)瑞NIPT技術(shù)基礎(chǔ)--DA8600測序平臺乳液PCR半導(dǎo)體測序：自然堿基，堿基結(jié)合釋放H+，化學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枩y序過程如何進(jìn)行？dNTPH+?

pH?

QSensingLayerSensorPlate?

VBulkDrainSourceSilicon

SubstrateTo

columnreceiverRothberg

J.M.

etal

Naturedoi:10.1038/nature102424種dNTP依次流過芯片165

M個孔，一孔一個測序反應(yīng)，檢測一條序列每孔實時快速檢測（僅需幾秒），檢測后此dNTP被清洗掉，然后下一個dNTP流入Sequencing:

Flows?

A

“flow”

is

the

event

ofexposingthechipto

one

particulardNTP(T,

A,C,or

G),followedbyawashingstep?

Thefloworderrepeats

withpattern:?

‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’T

A

C

G

T

A

C

G

T

C

T

G

A

G

C

A

T

C

G

A…

etc.Flows1-4Flows5-8…9-12TAC5’-SequencingPrimer-3’...---Ion

Sphere?ParticleP1seq3’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC

AGTCAAGCG

TCC

C

AT

GGAdaptator

A

Key

SeqSequenceof

InterrestFlows1-4Sequencing:

Flows?

A

“flow”

is

the

event

ofexposingthechipto

one

particulardNTP(T,

A,C,or

G),followedbyawashingstep?

Thefloworderrepeats

withpattern:?

‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’T

A

C

G

T

A

C

G

T

C

T

G

A

G

C

A

T

C

G

A…

etc.Flows1-4Flows5-8…9-12TACT

C3’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC

AG

TCAAGC

GTC

C

CATG5’-SequencingPrimer-3’...---Ion

Sphere?ParticleGAdaptator

A

Key

SeqSequenceof

InterrestP1seqFlows5-8Sequencing:

Flows?

A

“flow”

is

the

event

ofexposingthechipto

one

particulardNTP(T,

A,C,or

G),followedbyawashingstep?

Thefloworderrepeats

withpattern:?

‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’T

A

C

G

T

A

C

G

T

C

T

G

A

G

C

A

T

C

G

A…

etc.Flows1-4Flows5-8…9-12TCTT

C

A

G5’-SequencingPrimer-3’3’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC

AG

TCAAGC

GTC

C

CATG...---Ion

Sphere?ParticleGAdaptator

A

Key

SeqSequenceof

InterrestP1seqFlows9+Sequencing:

Flows?

A

“flow”

is

the

event

ofexposingthechipto

one

particulardNTP(T,

A,C,or

G),followedbyawashingstep?

Thefloworderrepeats

withpattern:?

‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’T

A

C

G

T

A

C

G

T

C

T

G

A

G

C

A

T

C

G

A…

etc.Flows1-4Flow5-8…9-12TCGT

C

A

G

T

T

C

G

C

A

G

G

GT

A

C5’-SequencingPrimer-3’3’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC

AG

TCAAGC

GTC

C

CATG...---Ion

Sphere?ParticleAAdaptator

A

Key

SeqSequence

of

InterestP1seqAnd

soon…NGS整體流程樣本提取測序文庫構(gòu)建信號放大分析樣本接收血漿分離不合格NIPT實QC檢測重抽血合格DNA提取驗流程濃度不合格<0.05ng/μLQubit檢測DNA重提取DNA重提取濃度合格>0.05ng/μL文庫構(gòu)建濃度不合格<0.2ng/μLQubit檢測濃度合格>0.2ng/μLOT（模板制備）ES（模板富集）測序1.樣本采集由醫(yī)院醫(yī)生或護(hù)士按照外周采血標(biāo)準(zhǔn)采集孕婦外周血，采集輕微顛倒采血管10次，立即分離或按采血管類型進(jìn)行相應(yīng)保存。101、Streck采血管（淺褐色蓋帽）/Ardent管（粉色蓋帽）（1）規(guī)格：10mL（2）采血量：7～10mL（3）保存：常溫（18～30℃）保存，72h處理2、EDTA抗凝管（紫色蓋帽）（1）規(guī)格：5/6mL（2）采血量：5mL，2管（3）保存：4℃保存，8h內(nèi)處理2.血漿分離溶血標(biāo)準(zhǔn)：如下圖1、2、3號樣本可以檢測，4、5號樣本需要重新采血。12345血漿分離后如不使用立即放入-20℃暫存或-80℃冰箱中保存。在-20℃暫存不能超過一個星期，長期保存需轉(zhuǎn)至-80℃保存，保存時間不超過18個月，凍融次數(shù)不超過5

次。3.

血漿游離DNA提取采用磁珠法提取血漿中游離的DNA，使用的磁珠表面包被有生物活性基團(tuán)的功能化載體，能與核酸發(fā)生吸附反應(yīng)。實驗主要包含裂解、結(jié)合、洗滌和洗脫幾個步驟。血漿游離DNA質(zhì)控采用life的Qubit

3.0來檢測DNA的濃

線性范圍BR：Broad

Range2到1000ng/uLHS

HS：HighSensitivity0.2到100ng/u，DNA濃度一般在0.05

ng/uL-0.5/uL之間。是否有必要檢測提取的游離DNA濃度？.

文庫構(gòu)建端修復(fù)反應(yīng)0.7加磁珠純化1.1加磁珠純化接頭片段篩選1.5磁珠純化R擴增增產(chǎn)物純化5.文庫定量采用qubit3.0或qPCR檢測文庫濃度，文庫濃度需大于0.2ng/ul，小于0.2ng/ul需要重新提取DNA建庫。如需精確定量可采用qPCR。是否需要Agilent2100測文庫長度和濃度？建議：

對采用物理超聲打斷或酶切打斷建成的文庫采用2100檢測。

母體外周血游離DNA長度穩(wěn)定，文庫主峰長度在260

bp左右，無需檢測文庫長度。6.模板制備實驗步驟：Ligate

Ion

Sphere?

ParticlesISPA

adapterP1adapterDNA

insert文庫Poolingem

PCROT儀清洗乳液PCR反應(yīng)液配制乳液PCR反應(yīng)ISPA

adapterP1adapter

DNA

insert全程

5OT產(chǎn)物處理注：相同特異性標(biāo)簽的文庫不可安排在同一個RUN7.模板富集管全程約40minC1磁珠

+鏈酶親和素生物素化的模板

+ISP非模板ISP8.上機測序?qū)嶒灢襟E：準(zhǔn)備上機文庫儀器清洗儀器初始化設(shè)置Plan清洗芯片校準(zhǔn)芯片上樣測序注入樣品（loading）9.結(jié)果分析——數(shù)據(jù)處理4通過web瀏覽器獲得結(jié)果檢出堿基并設(shè)置plan測序鑒定變異服務(wù)器DA600測序儀瀏覽器和插件服務(wù)器10.結(jié)果展示整個run的數(shù)據(jù)質(zhì)控NIPT分析插件結(jié)果展示要求大于4%要求大于3

M紅色：Z值為負(fù)數(shù)黑色：Z值為正數(shù)紫色：灰區(qū)數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)13個功能模塊孕婦信息管理、實驗流程控制、檢測結(jié)果審核、自動生成報告、結(jié)果統(tǒng)計管理于一體系統(tǒng)自動判斷結(jié)果自動判讀結(jié)果質(zhì)控分析質(zhì)量控制——系統(tǒng)自動判斷其他染色體異常提示CNV提示NIPT關(guān)鍵點--完整的樣本信息合理合規(guī)的實驗流程質(zhì)量控制——胎兒濃度

胎兒濃度低增加假陰性的風(fēng)險

3%或4%胎兒游離DNA含量是NIPT檢測的風(fēng)險關(guān)口212例懷有唐氏綜合征胎兒的孕婦4例Z-score低于31484例懷有正常胎兒的孕婦Canicket

al.,2013重視室間質(zhì)評結(jié)果質(zhì)量控制的關(guān)鍵點?

1.原始完整樣本信息的獲取?

2.樣本進(jìn)行血漿分離及DNA提取后的濃度檢測?

3.DNA文庫的濃度檢測及文庫庫檢?

4.芯片Loading率等，胎兒濃度，測序數(shù)據(jù)量及均一度，Z值分析，臨床判斷標(biāo)準(zhǔn)等?

5.對比產(chǎn)前診斷結(jié)果進(jìn)行回顧性實驗以及隨訪NIPT適合以下孕婦的篩查嗎？高齡孕婦（

預(yù)產(chǎn)期年齡達(dá)到

35歲）傳統(tǒng)篩查高危的孕婦（唐篩高風(fēng)險）NT檢測增厚的孕婦超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)異常的孕婦雙胎或多胎的孕婦NIPT對高危和低危人群的篩查有何區(qū)別？Sian

Taylor-Phillips,etal.

BMJOpen2016.doi:10.1136NT增厚EnlargedNT(≥3.5mm)in

the

first

trimester–

notallchromosomeaberrations

can

be

detected

by

NIPSrebniak

etal.

Molecular

Cytogenetics

(2016)

9:69NT增厚EnlargedNT(≥3.5mm)in

the

first

trimester–

notallchromosomeaberrations

can

be

detected

by

NIPSrebniak

etal.

Molecular

Cytogenetics

(2016)

9:69超聲異常Lean

Beulenetal.

UltrasoundObstet

Gynecol2017;

49:

721–728其他染色體異常Graziano

Pescia

,et

al.

Genetics

inMedicine,2016雙胎建議呂遠(yuǎn),雙胎妊娠胎兒游離

DNA比例及其影響因素研究

,中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,2016造成假陰性和假陽性的原因有哪些？

胎兒／胎盤染色體不一致局限性胎盤嵌合（Confined

Placental

Mosaicism,

CPM)（胎兒自救）假

母體自身染色體異常陽性母體基因組中拷貝數(shù)變異（Copy

Number

Variation,

CNV）母體染色體嵌合（Maternal

Mosaicism）母體存在惡性腫瘤（Maternal

Malignancy）

雙胎中一胎停育（Vanished

Twin）

其他原因數(shù)據(jù)分析、人為錯誤造成假陰性和假陽性的原因有哪些？胎兒為真正的嵌合體（True

FetalMosaicism,

TFM）胎兒游離DNA含量過低（如母體肥胖或孕周過低等引起）孕周過小假母體肥胖陰性IVF-ET妊娠雙胎妊娠免疫治療、肝素治療等等

胎兒／胎盤染色體不一致胎盤正常，

胎兒異常（胎盤自救）

其他原因測序深度、數(shù)據(jù)分析、人為錯誤摘自2017年7月第五屆胎兒疾病產(chǎn)前診治新進(jìn)展大會

蔣宇林教授演講通量測序用外周血胎兒染色體非整倍體（T21、T18

和

T13）家參考品途：用于高通量測序檢測系統(tǒng)（包括檢測試劑盒）檢測孕婦外周血胎兒染色體非整倍體（T21、T18

和

T13）的性能評價。通量測序用外周血胎兒染色體非整倍體（T21、T18和

T13）國家參考品組成：據(jù)量控制參考品：BAC

文庫（包括來自

21、18

和

13號染色體

BAC

以及混合

BAC

共

4個樣本）；性參考品：10%濃度的

40個

T21、T18和

T13流產(chǎn)組織樣本，共計

40

個樣本；缺失微重復(fù)參考品：微缺失微重復(fù)細(xì)胞系，其中含有

T18染色體微重復(fù)參考品

2個，共計

10個樣本；通量測序用外周血胎兒染色體非整倍體（T21、T18

和

T13）家參考品嵌合體參考品：70%和

30%嵌合比例

T21、T18和

T13樣本各

1個，共

6個樣本；檢測限參考品：