維生素K3的安全性評(píng)價(jià)

維生素K3的安全性評(píng)價(jià)第一頁(yè)，共三十六頁(yè)?；瘜W(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性概述化學(xué)藥物制劑經(jīng)眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、關(guān)節(jié)腔、皮膚、直腸、陰道、靜脈、動(dòng)脈、肌肉、皮下、靜脈旁和鞘內(nèi)等非口服途徑給藥，對(duì)用藥局部產(chǎn)生的毒性（如刺激性和過敏性等）和/或?qū)θ懋a(chǎn)生的毒性（如過敏性和溶血性等）。它是臨床前安全性評(píng)價(jià)的組成部分。藥物的活性成分及其代謝物、輔料、有關(guān)物質(zhì)及理化性質(zhì)（如pH值、滲透壓等）均有可能引起刺激性和/或過敏性和/或溶血性的發(fā)生，而嚴(yán)重的毒性可以影響用藥的安全有效性，因此藥物在臨床應(yīng)用前應(yīng)研究其制劑在給藥部位使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示臨床應(yīng)用時(shí)可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)、毒性靶器官、安全范圍、臨床研究監(jiān)測(cè)指標(biāo)并為臨床解毒或解救措施提供參考，保障臨床用藥的安全有效。第二頁(yè)，共三十六頁(yè)。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目1.刺激性（皮膚刺激性試驗(yàn)；眼刺激性試驗(yàn)；注射給藥部位刺激性試驗(yàn)：血管刺激性實(shí)驗(yàn)、肌肉刺激性實(shí)驗(yàn)。）2.過敏性3.溶血性實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)遵循隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)的原則。試驗(yàn)用藥物應(yīng)與用于人體的制劑一致觀察部位應(yīng)選擇給藥部位，同時(shí)考慮選擇周圍組織或可能暴露于受試藥物的部位。第三頁(yè)，共三十六頁(yè)。刺激性試驗(yàn)刺激性是指非口服藥物制劑給藥后對(duì)給藥部位產(chǎn)生的可逆性炎癥改變，若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹坑^察動(dòng)物局部接觸受試物后所產(chǎn)生的刺激反應(yīng)，提示藥物臨床應(yīng)用后給藥部位可能出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)、組織的變性和壞死等不良反應(yīng)。第四頁(yè)，共三十六頁(yè)。刺激性試驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)考慮的問題⒈實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇依據(jù)觀察指標(biāo)和擬采用試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦x擇試驗(yàn)動(dòng)物，一般每個(gè)試驗(yàn)選擇一種動(dòng)物進(jìn)行評(píng)價(jià)。⒉給藥的頻率與期限給藥頻率和期限應(yīng)依據(jù)擬定臨床應(yīng)用的情況來決定。重復(fù)給藥試驗(yàn)，一般每天給藥一次，給藥期限最長(zhǎng)不超過4周。偶爾給藥的受試物可用單次給藥的方法進(jìn)行試驗(yàn)。⒊可逆性觀察為明確毒性反應(yīng)的恢復(fù)情況，建議進(jìn)行停藥后恢復(fù)期的觀察。局部毒性反應(yīng)的可逆性評(píng)價(jià)應(yīng)包括局部及相關(guān)部位的反應(yīng)。第五頁(yè)，共三十六頁(yè)。刺激性試驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)考慮的問題⒋受試物受試物應(yīng)與用于人體的制劑一致。⒌對(duì)照組以溶媒和/或賦形劑作為陰性對(duì)照。必要時(shí)采用陽(yáng)性對(duì)照或已上市制劑。⒍劑量劑量設(shè)計(jì)主要應(yīng)該考慮受試物濃度和總劑量。一般采用與臨床制劑相同濃度，設(shè)一個(gè)劑量組，可以通過改變給藥頻率進(jìn)行劑量的調(diào)整，但皮膚給藥刺激性研究通過增加涂敷厚度或加大涂布面積來提高給藥劑量是不合適的。必要時(shí)應(yīng)該進(jìn)行不同濃度的刺激性試驗(yàn)。第六頁(yè)，共三十六頁(yè)。刺激性試驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)考慮的問題⒎給藥方式7.1給藥方案應(yīng)盡量與臨床用藥方案一致。7.2給藥途徑和給藥部位應(yīng)與臨床用藥一致。7.3設(shè)計(jì)給藥容積，給藥速率和給藥頻率時(shí)，應(yīng)考慮所選用動(dòng)物模型給藥部位的解剖和生理特點(diǎn)。⒏只要相互之間不影響且全身耐受性許可，則可在同一動(dòng)物身上進(jìn)行不同給藥途徑的刺激性試驗(yàn)研究，并可在對(duì)側(cè)進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。第七頁(yè)，共三十六頁(yè)。刺激性試驗(yàn)皮膚刺激性試驗(yàn)

皮膚刺激性是指動(dòng)物經(jīng)皮膚給予受試物后在皮膚上產(chǎn)生的可逆性炎癥改變，若產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則為皮膚腐蝕性。

目的觀察動(dòng)物皮膚接觸受試物后所產(chǎn)生的刺激反應(yīng)，提示藥物臨床應(yīng)用后皮膚可能出現(xiàn)的炎癥、組織變性和壞死等不良反應(yīng)。

第八頁(yè)，共三十六頁(yè)。皮膚刺激性試驗(yàn)試驗(yàn)方法試驗(yàn)動(dòng)物：首選家兔，動(dòng)物數(shù)4－8只，雌、雄各半。應(yīng)設(shè)賦形劑對(duì)照，采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法。試驗(yàn)前24小時(shí)對(duì)給藥區(qū)（通常在背部）進(jìn)行脫毛處理（可剪、剃或用適宜的脫毛劑）。去毛范圍左、右各3cm×3cm。給藥前應(yīng)檢查去毛皮膚是否因去毛而受損傷，有損傷的皮膚不宜進(jìn)行試驗(yàn)。但若需考察破損皮膚的刺激性，則可在用藥部位用砂紙磨或劃“井”字并以滲血為度。第九頁(yè)，共三十六頁(yè)。皮膚刺激性試驗(yàn)試驗(yàn)方法受試物的給予：取受試物0.5ml直接涂布于一側(cè)已去毛的皮膚上，然后用二層紗布（2.5cm×2.5cm）和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定；另一側(cè)涂布賦型劑做對(duì)照。貼敷時(shí)間至少4小時(shí)。貼敷結(jié)束后，除去受試物并用溫水或無刺激性溶劑清潔給藥部位。多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)應(yīng)連續(xù)在同一部位給藥，每次給藥時(shí)間相同，貼敷期限一般不超過4周。第十頁(yè)，共三十六頁(yè)。皮膚刺激性試驗(yàn)試驗(yàn)方法動(dòng)物觀察：在自然光線或全光譜燈光下觀察皮膚反應(yīng)。單次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)，在去除藥物后30-60分鐘，24、48和72小時(shí)肉眼觀察并記錄涂敷部位有無紅斑和水腫等情況。對(duì)出現(xiàn)中度及以上皮膚刺激性的動(dòng)物應(yīng)在觀察期結(jié)束時(shí)對(duì)給藥局部進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。第十一頁(yè)，共三十六頁(yè)。刺激性試驗(yàn)眼刺激性試驗(yàn)眼刺激性是指動(dòng)物經(jīng)眼給予受試物后在眼前部表面產(chǎn)生的可逆性組織改變，若產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則為腐蝕性。

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目的觀察動(dòng)物經(jīng)眼給予受試物后所產(chǎn)生的刺激性反應(yīng)，提示藥物臨床應(yīng)用后眼可能出現(xiàn)的炎癥、組織變性和壞死等不良反應(yīng)。

第十二頁(yè)，共三十六頁(yè)。眼刺激性試驗(yàn)試驗(yàn)方法試驗(yàn)動(dòng)物：首選家兔，動(dòng)物數(shù)每組不少于3只。應(yīng)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組，可采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法。試驗(yàn)前24小時(shí)內(nèi)對(duì)每只動(dòng)物的雙眼進(jìn)行檢查（包括使用熒光素鈉檢查）。有眼睛刺激癥狀、角膜缺陷和結(jié)膜損傷的動(dòng)物不能用于試驗(yàn)。

第十三頁(yè)，共三十六頁(yè)。眼刺激性試驗(yàn)給藥方法：每只眼睛滴入0.1ml或涂敷0.1g受試物，然后輕合眼瞼約10s。一般不需沖洗眼睛。用藥周期應(yīng)根據(jù)藥物擬用于臨床的情況來決定，多次給藥一般不超過4周。

第十四頁(yè)，共三十六頁(yè)。眼刺激性試驗(yàn)眼部觀察：?jiǎn)未谓o藥眼刺激試驗(yàn)，在給藥后1、24、48和72小時(shí)對(duì)眼部進(jìn)行檢查；多次給藥眼刺激試驗(yàn)，每天給藥前以及最后一次給藥后1、24、48和72小時(shí)對(duì)眼部進(jìn)行檢查。如果在72小時(shí)未見任何刺激癥狀，試驗(yàn)則可結(jié)束。如存在持久性損傷，有必要延長(zhǎng)觀察期限。但一般不超過21天。

第十五頁(yè)，共三十六頁(yè)。溶血性試驗(yàn)溶血性是指藥物制劑引起的血管外或血管內(nèi)溶血和紅細(xì)胞凝聚等反應(yīng)。溶血性反應(yīng)包括免疫性溶血與非免疫性溶血。免疫性溶血是藥物通過免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體而引起的溶血，為Ⅱ型和Ⅲ型過敏反應(yīng)；非免疫性溶血包括藥物為誘發(fā)因素導(dǎo)致的氧化性溶血和藥物制劑引起血液穩(wěn)態(tài)的改變而出現(xiàn)的溶血和紅細(xì)胞凝聚等。

第十六頁(yè)，共三十六頁(yè)。注射給藥部位刺激性試驗(yàn)

注射給藥部位刺激性是指動(dòng)物經(jīng)注射給予受試物后在注射部位產(chǎn)生的可逆性組織改變，若產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則為腐蝕性。目的觀察動(dòng)物注射受試物后所產(chǎn)生的刺激性反應(yīng)，提示藥物臨床應(yīng)用后注射部位可能出現(xiàn)的炎癥、組織變性和壞死等不良反應(yīng)。第十七頁(yè)，共三十六頁(yè)。注射給藥部位刺激性試驗(yàn)試驗(yàn)方法

1.試驗(yàn)動(dòng)物：首選家兔，動(dòng)物數(shù)每組不少于3只。應(yīng)設(shè)生理鹽水對(duì)照，可采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法。用藥部位根據(jù)藥物的給藥途徑確定，可選用耳緣靜脈，耳中心動(dòng)脈（其它動(dòng)物可選用前、后肢靜脈及股動(dòng)脈等），股和背部肌肉，側(cè)胸壁皮下組織，靜脈旁組織等。2.給藥方法：按臨床使用情況給予受試物，給藥容積和速率應(yīng)根據(jù)動(dòng)物情況進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。給藥期限應(yīng)根據(jù)藥物擬用于臨床的情況來決定，多次給藥一般不超過7天。第十八頁(yè)，共三十六頁(yè)。注射給藥部位刺激性試驗(yàn)試驗(yàn)方法3.動(dòng)物觀察：?jiǎn)未谓o藥刺激性試驗(yàn)，在給藥后48-96小時(shí)對(duì)動(dòng)物和注射部位進(jìn)行肉眼觀察；多次給藥刺激性試驗(yàn)，每天給藥前以及最后一次給藥后48-96小時(shí)對(duì)動(dòng)物和注射部位進(jìn)行肉眼觀察。觀察期結(jié)束時(shí)應(yīng)對(duì)部分動(dòng)物進(jìn)行給藥部位組織病理學(xué)檢查。留下的動(dòng)物根據(jù)受試物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)情況，繼續(xù)觀察14－21天再進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，以了解刺激性反應(yīng)的可逆程度。4.結(jié)果評(píng)價(jià)：根據(jù)肉眼觀察和病理檢查的結(jié)果，對(duì)受試物使用的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

第十九頁(yè)，共三十六頁(yè)。實(shí)驗(yàn)材料器材：注射器1ml5支。藥品：維生素K3注射液、生理鹽水。動(dòng)物：2.0～2.2kg家兔4只，雌雄各半。

家兔股四頭肌法

第二十頁(yè)，共三十六頁(yè)。方法與步驟取家兔4只,每只家兔一側(cè)股四頭肌內(nèi)注射維生素K3注射液1ml，另一側(cè)注射同體積生理鹽水。注射后觀察注射部位肌肉有無充血、水腫等反應(yīng),注射后48h后用空氣栓塞法處死動(dòng)物，解剖取出股四頭肌，縱向切開，觀察注射部位肌肉的刺激反應(yīng)，按肌肉刺激反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算相應(yīng)的反應(yīng)級(jí)，并進(jìn)行局部組織病理學(xué)檢查，提供病理照片。第二十一頁(yè)，共三十六頁(yè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論第二十二頁(yè)，共三十六頁(yè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論【結(jié)果與討論】根據(jù)肉眼觀察和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。第二十三頁(yè)，共三十六頁(yè)。實(shí)驗(yàn)材料器材：注射器1ml5支。藥品：維生素K3注射液、生理鹽水。動(dòng)物：2.0～2.2kg家兔4只，雌雄各半。

家兔耳殼法

是注射劑刺激性初試的一種方法。因家兔耳殼較薄，將藥物注射于耳殼皮下后，其刺激性反應(yīng)易于在透光檢查中發(fā)現(xiàn)，而不需處死動(dòng)物，試驗(yàn)成本相對(duì)較低。第二十四頁(yè)，共三十六頁(yè)。方法與步驟取家兔4只，每只家兔一側(cè)耳緣靜脈內(nèi)注射維生素K3注射液1ml，另一側(cè)注射同體積生理鹽水。注射48～96h后觀察注射部位肌肉有無充血、水腫等反應(yīng),觀察結(jié)束后用空氣栓塞法處死動(dòng)物，進(jìn)行給藥部位組織病理學(xué)檢查，并提供病理照片。【結(jié)果與討論】根據(jù)肉眼觀察和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。第二十五頁(yè)，共三十六頁(yè)。溶血性試驗(yàn)?zāi)康目疾焖幬锸欠衲軌蛞鹧芡饣蜓軆?nèi)溶血和紅細(xì)胞凝聚等反應(yīng)。凡是注射劑和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反應(yīng)的其他藥物制劑均應(yīng)進(jìn)行溶血性試驗(yàn)。第二十六頁(yè)，共三十六頁(yè)。溶血性試驗(yàn)溶血性試驗(yàn)方法1、常規(guī)的體外試管法(肉眼觀察法)1.1血細(xì)胞懸液的配制

取兔血(或羊血)數(shù)毫升,放入含玻璃珠的三角燒瓶中振搖10分鐘,或用玻璃棒攪動(dòng)血液,除去纖維蛋白原,使成脫纖血液.加入0.9%氯化鈉溶液約10倍量,搖勻,1000-1500r/min離心15分鐘,除去上清液,沉淀的紅細(xì)胞再用0.9%氯化鈉溶液按上述方法洗滌2-3次,至上清液不顯紅色為止.將所得紅細(xì)胞用0.9%氯化鈉溶液配成2%的混懸液,供試驗(yàn)用.第二十七頁(yè)，共三十六頁(yè)。溶血性試驗(yàn)溶血性試驗(yàn)方法1、常規(guī)的體外試管法(肉眼觀察法)1.2受試物的制備

除另有規(guī)定外,臨床用于非血管內(nèi)途徑給藥的注射劑,以各藥品使用說明書規(guī)定的臨床使用濃度,用0.9%氯化鈉溶液1∶3稀釋后作為供試品溶液;用于血管內(nèi)給藥的注射劑以使用說明書規(guī)定的臨床使用濃度作為供試品溶液。第二十八頁(yè)，共三十六頁(yè)。溶血性試驗(yàn)溶血性試驗(yàn)方法1、常規(guī)的體外試管法(肉眼觀察法)1.3試驗(yàn)方法

取潔凈試管7只,進(jìn)行編號(hào),1-5號(hào)管為供試品管,6號(hào)管為陰性對(duì)照管,7號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照管.按下表所示依次加入2%紅細(xì)胞懸液、0.9%氯化鈉溶液或蒸餾水,混勻后,立即置37℃±0.5℃的恒溫箱中進(jìn)行溫育,開始每隔15分鐘觀察1次,1小時(shí)后,每隔1小時(shí)觀察1次,一般觀察3小時(shí).

按下列順序加入各種溶液

第二十九頁(yè)，共三十六頁(yè)。溶血性試驗(yàn)結(jié)果觀察

若試驗(yàn)中的溶液呈澄明紅色,管底無細(xì)胞殘留或有少量紅細(xì)胞殘留,表明有溶血發(fā)生;如紅細(xì)胞全部下沉,上清液體無色澄明,表明無溶血發(fā)生.若溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀,振搖后不分散,表明有紅細(xì)胞凝聚發(fā)生.如有紅細(xì)胞凝聚的現(xiàn)象,可按下法進(jìn)一步判定是真凝聚還是假凝聚.若凝聚物在試管振蕩后又能均勻分散,或?qū)⒛畚锓旁谳d玻片上,在蓋玻片邊緣滴加2滴0.9%氯化鈉溶液,置顯微鏡下觀察,凝聚紅細(xì)胞能被沖散者為假凝聚,若凝聚物不被搖散或在玻片上不被沖散者為真凝聚.第三十頁(yè)，共三十六頁(yè)。溶血性試驗(yàn)第三十一頁(yè)，共三十六頁(yè)。溶血性試驗(yàn)結(jié)果觀察

分光光度法：肉眼觀察結(jié)束后，將各管的溶液置入離心機(jī)1500rpm離心15min，取上清液，在紫外可見分光光度計(jì)545nm波長(zhǎng)處，以蒸餾水為空白，測(cè)試各管吸光度值。用下式計(jì)算各試驗(yàn)管的溶血率（%）。溶血率（%）=（ODt-ODnc）/（ODpc-ODnc）×100%式中：ODt：試驗(yàn)管吸光度ODnc：陰性對(duì)照管吸光度ODpc：陽(yáng)性對(duì)照管吸光度觀察指標(biāo)及時(shí)間：觀察加入2%兔紅細(xì)胞懸浮液15min，30min，45min和1h，2h