基因敲除提要

基因敲除基因敲除（knockout）是指一種遺傳工程技術(shù)，針對(duì)某個(gè)序列已知但功能未知的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被屏蔽，并可進(jìn)一步對(duì)生物體造成影響，進(jìn)而推測(cè)出該基因的生物學(xué)功能。指外源DNA與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細(xì)胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細(xì)胞的基因組中。此法可產(chǎn)生精確的基因突變，也可正確糾正機(jī)體的基因突變?；蚯度胗址Q基因置換，它是利用內(nèi)源基因序列兩側(cè)或外面的斷裂點(diǎn)，用同源序列的目的基因整個(gè)置換內(nèi)源基因。用于基因敲除和基因嵌入的技術(shù)有Cre/LoxP系統(tǒng)、FLPI系統(tǒng)等。步驟：獲得干細(xì)胞基因敲除一般應(yīng)用于鼠，而最常用的鼠的種系是129及其雜合體，因?yàn)檫@類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。而其他遺傳背景的胚胎干細(xì)胞系逐漸被發(fā)展應(yīng)用，最來(lái)自于C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎干細(xì)胞系成功地用于基因敲除。由于這些遠(yuǎn)交系遺傳背景復(fù)雜，所得到的模式小鼠往往不能得到重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以也需要在C57BL/6等近交系小鼠上做回交。另一方面，因?yàn)榛亟淮螖?shù)不一樣，也會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差。這對(duì)生物科研，尤其是醫(yī)藥企業(yè)，安評(píng)中心，藥檢部門等，是一個(gè)很大的缺點(diǎn)。這對(duì)開(kāi)發(fā)制作標(biāo)準(zhǔn)模式動(dòng)物也是一個(gè)很大的缺陷。所以，如果能夠直接用C57BL/6ES細(xì)胞進(jìn)行基因打靶，就將直接獲得C57BL/6品系的模式小鼠。c57BL/6小鼠種系等已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于免疫學(xué)，神經(jīng)學(xué)，癌癥，等幾乎所有研究領(lǐng)域。已經(jīng)有一些公司或科研機(jī)構(gòu)已經(jīng)開(kāi)始用C57BL/6遺傳背景的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行基因打靶。載體構(gòu)建把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，此重組載體即為打靶載體。因基因打靶的目的不同，此載體有不同的設(shè)計(jì)方法，可分為替換性載體和插入型載體。如為了把某一外源基因引入染色體DNA的某一位點(diǎn)上，這種情況下應(yīng)設(shè)計(jì)的插入型載體要包括外源基因(即目的基因)、同源基因片段及標(biāo)記基因等部分。如為了使某一基因失去其生理功能，這時(shí)所要設(shè)計(jì)的替換型打靶載體，應(yīng)包括含有此靶基因的啟動(dòng)子及第一外顯子的DNA片段及標(biāo)記基因等諸成分。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，打靶載體分為全基因敲除，條件性基因敲除，基因敲進(jìn)，誘導(dǎo)性基因敲除等打靶載體。導(dǎo)入基因?qū)⒒虼虬休d體通過(guò)一定的方式(常用電穿孔法)導(dǎo)入同源的胚胎干細(xì)胞(EScell)中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將打靶載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中從而得以表達(dá)。一般地，顯微注射命中率較高，但技術(shù)難度較大，電穿孔命中率比顯微注射低，但便于使用。用選擇性培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞一般地，篩選使用正、負(fù)選擇法，比如用G418篩選所有能表達(dá)neo基因的細(xì)胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表達(dá)的細(xì)胞，剩下的細(xì)胞為命中的細(xì)胞。由于用于TK篩選的Gancyclovir對(duì)小鼠的種系傳遞有影響，一般采用DTA(白喉毒素A亞基）進(jìn)行陰性篩選。將篩選出來(lái)的靶細(xì)胞導(dǎo)入鼠的囊胚中，再將此囊胚植人假孕母鼠體內(nèi)，使其發(fā)育成嵌合體小鼠。性狀改變通過(guò)觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進(jìn)而了解目的基因變化前后對(duì)小鼠的生物學(xué)性狀的改變，達(dá)到研究目的基因的目的。誘導(dǎo)性基因敲除法誘導(dǎo)性基因敲除也是以Cre/loxp系統(tǒng)為基礎(chǔ)，但卻是利用控制Cre表達(dá)的啟動(dòng)子的活性或所表達(dá)的Cre酶活性具有可誘導(dǎo)的特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的控制或利用Cre基因定位表達(dá)系統(tǒng)中載體的宿主細(xì)胞特異性和將該表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)的過(guò)程在時(shí)間上的可控性，從而在1oxP動(dòng)物的一定發(fā)育階段和一定組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因進(jìn)行遺傳修飾之目的的基因敲除技術(shù)。人們可以通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的預(yù)先設(shè)計(jì)的方式來(lái)對(duì)動(dòng)物基因突變的時(shí)空特異性進(jìn)行人為控制、以避免出現(xiàn)死胎或動(dòng)物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。常見(jiàn)的幾種誘導(dǎo)性類型如下：四環(huán)素誘導(dǎo)型(圖4)；干擾素誘導(dǎo)型；激素誘導(dǎo)型；腺病毒介導(dǎo)型。誘導(dǎo)性基因敲除優(yōu)點(diǎn)：①誘導(dǎo)基因突變的時(shí)間可人為控制；②可避免因基因突變而致死胎的問(wèn)題③在2個(gè)loxP位點(diǎn)之間的重組率較高；④如用病毒或配體/DNA復(fù)合物等基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)來(lái)介導(dǎo)Cre的表達(dá)，則可省去建立攜帶Cre的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的過(guò)程。[10]2.2利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除。2.2.1原理：此法利用某些能隨機(jī)插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫(kù)，然后通過(guò)相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞（原理見(jiàn)圖5）[11,12]。根據(jù)細(xì)胞的不同，插入載體的選擇也有所不同。逆