基因敲除提要

基因敲除基因敲除（knockout）是指一種遺傳工程技術，針對某個序列已知但功能未知的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被屏蔽，并可進一步對生物體造成影響，進而推測出該基因的生物學功能。指外源DNA與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細胞的基因組中。此法可產生精確的基因突變，也可正確糾正機體的基因突變?；蚯度胗址Q基因置換，它是利用內源基因序列兩側或外面的斷裂點，用同源序列的目的基因整個置換內源基因。用于基因敲除和基因嵌入的技術有Cre/LoxP系統(tǒng)、FLPI系統(tǒng)等。步驟：獲得干細胞基因敲除一般應用于鼠，而最常用的鼠的種系是129及其雜合體，因為這類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。而其他遺傳背景的胚胎干細胞系逐漸被發(fā)展應用，最來自于C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎干細胞系成功地用于基因敲除。由于這些遠交系遺傳背景復雜，所得到的模式小鼠往往不能得到重復性好的實驗結果，所以也需要在C57BL/6等近交系小鼠上做回交。另一方面，因為回交次數不一樣，也會造成實驗結果重復性差。這對生物科研，尤其是醫(yī)藥企業(yè)，安評中心，藥檢部門等，是一個很大的缺點。這對開發(fā)制作標準模式動物也是一個很大的缺陷。所以，如果能夠直接用C57BL/6ES細胞進行基因打靶，就將直接獲得C57BL/6品系的模式小鼠。c57BL/6小鼠種系等已經廣泛的應用于免疫學，神經學，癌癥，等幾乎所有研究領域。已經有一些公司或科研機構已經開始用C57BL/6遺傳背景的胚胎干細胞進行基因打靶。載體構建把目的基因和與細胞內靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，此重組載體即為打靶載體。因基因打靶的目的不同，此載體有不同的設計方法，可分為替換性載體和插入型載體。如為了把某一外源基因引入染色體DNA的某一位點上，這種情況下應設計的插入型載體要包括外源基因(即目的基因)、同源基因片段及標記基因等部分。如為了使某一基因失去其生理功能，這時所要設計的替換型打靶載體，應包括含有此靶基因的啟動子及第一外顯子的DNA片段及標記基因等諸成分。根據實驗目的不同，打靶載體分為全基因敲除，條件性基因敲除，基因敲進，誘導性基因敲除等打靶載體。導入基因將基因打靶載體通過一定的方式(常用電穿孔法)導入同源的胚胎干細胞(EScell)中，使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應部分發(fā)生同源重組，將打靶載體中的DNA序列整合到內源基因組中從而得以表達。一般地，顯微注射命中率較高，但技術難度較大，電穿孔命中率比顯微注射低，但便于使用。用選擇性培養(yǎng)基篩選已擊中的細胞一般地，篩選使用正、負選擇法，比如用G418篩選所有能表達neo基因的細胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表達的細胞，剩下的細胞為命中的細胞。由于用于TK篩選的Gancyclovir對小鼠的種系傳遞有影響，一般采用DTA(白喉毒素A亞基）進行陰性篩選。將篩選出來的靶細胞導入鼠的囊胚中，再將此囊胚植人假孕母鼠體內，使其發(fā)育成嵌合體小鼠。性狀改變通過觀察嵌和體小鼠的生物學形狀的變化進而了解目的基因變化前后對小鼠的生物學性狀的改變，達到研究目的基因的目的。誘導性基因敲除法誘導性基因敲除也是以Cre/loxp系統(tǒng)為基礎，但卻是利用控制Cre表達的啟動子的活性或所表達的Cre酶活性具有可誘導的特點，通過對誘導劑給予時間的控制或利用Cre基因定位表達系統(tǒng)中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統(tǒng)轉移到動物體內的過程在時間上的可控性，從而在1oxP動物的一定發(fā)育階段和一定組織細胞中實現(xiàn)對特定基因進行遺傳修飾之目的的基因敲除技術。人們可以通過對誘導劑給予時間的預先設計的方式來對動物基因突變的時空特異性進行人為控制、以避免出現(xiàn)死胎或動物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。常見的幾種誘導性類型如下：四環(huán)素誘導型(圖4)；干擾素誘導型；激素誘導型；腺病毒介導型。誘導性基因敲除優(yōu)點：①誘導基因突變的時間可人為控制；②可避免因基因突變而致死胎的問題③在2個loxP位點之間的重組率較高；④如用病毒或配體/DNA復合物等基因轉移系統(tǒng)來介導Cre的表達，則可省去建立攜帶Cre的轉基因動物的過程。[10]2.2利用隨機插入突變進行基因敲除。2.2.1原理：此法利用某些能隨機插入基因序列的病毒，細菌或其他基因載體，在目標細胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然后通過相應的標記進行篩選獲得相應的基因敲除細胞（原理見圖5）[11,12]。根據細胞的不同，插入載體的選擇也有所不同。逆